Ομοιοστατικοί μηχανισμοί κυτταροτοξικών Τ λεμφοκυττάρων σε μοντέλα διαγονιδιακών και ελλειματικών ποντικιών

Abstract

Vertebrates have developed complex immune systems comprised of cells, molecules and mechanisms capable to cope with invading microorganisms. It is equally important that mechanisms assuring immune system homeostasis and protection of self-tissues from immune reactivity are developed too. The latter group of mechanisms is collectively called immunological tolerance. T cell tolerance can be established either in the thymus (central tolerance) or/and in the peripheral lymphoid organs (peripheral tolerance). To study the peripheral CD8 T cell tolerance we used transgenic mice expressing the NP nucleoprotein of an influenza virus. We also used TCR transgenic mice expressing the F5 T cell receptor, which is able to recognize an NP epitope in the context of the Db MHC I molecule, and double transgenic F5/NP mice. There is no negative selection (central tolerance) observed in F5/NP thymocytes. However, there is a marked clonal deletion of F5 CD8 T cells in the periphery of F5/NP mice. Moreover, F5 cells that escaped clonal deletion have become severely hyporeactive to a second challenge with antigen in vitro, a state that is termed T cell anergy. F5/NP CD8 T cells hyporeacivity is at least partly due to low IL-2 receptor expression following stimulation and that probably explains the partial reversion of the anergic phenotype after addition of exogenous IL-2, since anergic F5/NP T cells can not properly utilize this cytokine. More evidence that tolerance induction in F5/NP mice takes place in the periphery is the fact that naïve F5 T cells transferred to NP expressing recipients are soon rendered anergic in host’s tissues. Using the models described above, we showed that anergy induction of F5 T cells is preceded by activation as judged by high expression of surface activation markers and clonal expansion of F5 T cells in transfer experiments. This indicates that in our models anergy is induced by chronic exposure to antigen presented by APCs and not by lack of costimulation. We tried to identify novel genes that are involved in the induction and/or the persistence of anergy in F5/NP CD8 T cells. To do so we used the mRNA Differential Display technology on RNA populations from purified naïve F5 and anergic F5/NP CD8 T cells. After an extensive pursuit we ended up with one differentially expressed transcript corresponding to the SLP-65 gene, which is upregulated in the anergic F5/NP T cells compared to the naïve F5. In this study, we also tried to assess the role of TNF and Fas, two members of the TNF/TNFR superfamily, on the adaptive immune system and specifically on CD8 T cells. In particular, we showed that lack of endogenous TNF results to lower numbers of peripheral F5 cells as well as to reduced homeostatic proliferation after adoptive transfer to lymphopenic hosts. It is of interest that T cell derived rather than host derived TNF has the major contribution to homeostatic expansion of transferred F5 T cells. Furthermore we showed that F5/TNF-/- CD8 T cells respond to the antigen, in vitro and in vivo, in a lesser extent compared to F5 ones. Namely, they exhibit a lower division rate and express lower levels of surface activation markers after encountering the antigen. The lower degree of activation is accompanied and can be correlated with lower activation induced cell death (AICD). This influence of TNF mutation is not restricted to the F5 T cell clone but is rather polyclonal since a-CD3 activation of TNF-/- T cells results to less activation and AICD compared to TNF+/+ T cells. These defective TNF-/- T cell responses can be well attributed, at least partly, to defective NF-κB and NF-ATp activation that we have identified in F5/TNF-/- T cells. Our results showed that TNF plays a non-compensatory role in CD8 T lymphocyte tolerance. Potentially autoreactive F5/NP T cells undergo decreased clonal deletion in a TNF-/- background. In addition F5/NP/TNF-/- cells that escaped clonal deletion are considerably reactive after rechallenge with NP antigen in vitro compared to F5/NP. On top of that, anergy induction is compromised when transferring naïve F5 CD8 T cells in NP recipients the absence of TNF. Overall our results point out to a pivotal role of TNF on modulating CD8 T cell functions by enhancing TCR signaling for both low and high affinity ligands. Our results with lpr mice (a mutation that renders fas gene inactive) showed that Fas has a minor role in the maintenance of normal populations of peripheral naïve F5/CD8 T cells in young mice. Moreover, there is an additive effect of the Fas mutation to the TNF mutation as far as it concerns numbers of peripheral F5 CD8 T cells. There is no obvious participation of Fas to activation induced apoptosis of F5 T cells in vivo as judged by transfer experiments in NP expressing mice. In addition, there was no discernible role of Fas in this type of experiments even if F5 T cells were unable to produce both TNF and Fas. There is also not an apparent role of endogenous Fas either to F5/NP CD8 T cells clonal deletion or to the establishment of their anergic phenotype.

Το ανοσοποιητικό σύστημα έχει αναπτύξει μηχανισμούς για την αντιμετώπιση των παθογόνων μικροοργανισμών. Παράλληλα με αυτούς αναπτύχθηκαν και ομοιοστατικοί μηχανισμοί που επαναφέρουν το σύστημα κοντά στην αρχική του κατάσταση και επιπλέον μηχανισμοί αποτρέπουν την ανοσοαπάντηση εναντίον συστατικών του εαυτού. Η δεύτερη αυτή ομάδα μηχανισμών ονομάζεται συνολικά ανοσολογική ανοχή. Η ανοχή των Τ λεμφοκυττάρων μπορεί να εγκαθιδρυθεί είτε στο θύμο (κεντρική ανοχή) ή/και στα περιφερικά λεμφοειδή όργανα (περιφερική ανοχή). Για να μελετήσουμε την περιφερική ανοχή των CD8 Τ λεμφοκυττάρων χρησιμοποιήσαμε ποντίκια διαγονιδιακά για την πρωτεΐνη ΝΡ του ιού της γρίπης. Επίσης χρησιμοποιήσαμε ποντίκια διαγονιδιακά για έναν συγκεκριμένο Τ υποδοχέα, τον F5, που αναγνωρίζει έναν επίτοπο της πρωτεΐνης ΝΡ παρουσιαζόμενο από το τάξης Ι ΜΗC μόριο Dᵇ. Επίσης χρησιμοποιήθηκαν διπλά διαγονιδιακά ποντίκια F5/ΝΡ. Στα F5/ΝΡ ποντίκια δεν παρατηρείται αυξημένη αρνητική επιλογή των F5 θυμοκυττάρων (κεντρική ανοχή). Αντίθετα υπάρχει έκδηλη κλωνική απαλοιφή των F5 CD8 Τ κυττάρων στα περιφερικά λεμφοειδή όργανα των F5/ΝΡ ποντικιών. Επιπλέον τα εναπομείναντα CD8 Τ κύτταρα είναι άνεργα μιας και δεν πολλαπλασιάζονται σε δεύτερη διέγερση στο ΝΡ αντιγόνο in vitro. Η υποδραστικότητα των F5/ΝΡ CD8 Τ λεμφοκυττάρων οφείλεται τουλάχιστον εν μέρει στην ανικανότητά τους να αυξήσουν τα επίπεδα του υποδοχέα της ΙL-2 ώστε να μη μπορούν να αξιοποιήσουν επαρκώς την IL-2, κάτι που πιθανώς εξηγεί την μερική μόνο αναστροφή του άνεργου φαινοτύπου μετά την προσθήκη εξωγενούς ΙL-2. Επιβεβαιωτικό του ότι η ανέργεια των F5 Τ λεμφοκυττάρων επάγεται πράγματι στην περιφέρεια είναι πως περιφερικά παρθένα F5 κύτταρα που μεταφέρονται σε ΝΡ αποδέκτες καθίστανται άνεργα μετά από κάποια χρονική περίοδο. Στα παραπάνω μοντέλα δείξαμε ότι πριν την επαγωγή ανέργειας έχει προηγηθεί ενεργοποίηση των F5 CD8 Τ κυττάρων όπως υποδηλώνουν οι αυξημένοι μάρτυρες ενεργοποίησης αλλά και η κλωνική επέκταση των F5 Τ κυττάρων στα πειράματα μεταφοράς. Έτσι, η επαγωγή ανέργειας στα παραπάνω μοντέλα προέρχεται κυρίως από παρατεταμένη έκθεση στο αντιγόνο που παρουσιάζεται από κύτταρα αντιγονοπαρουσιαστές (APCs) και όχι από έλλειψη συνδιέγερσης. Προσπαθήσαμε να ταυτοποιήσουμε νέα γονίδια που να εμπλέκονται στην εγκαθίδρυση ή/και στην επαγωγή της ανέργειας στα F5/ΝΡ CD8 Τ κύτταρα. Για το λόγο αυτό χρησιμοποιήσαμε την τεχνολογία του mRNA Differential Display σε RNAs από παρθένα F5 CD8 Τ κύτταρα και άνεργα F5/ΝΡ CD8 Τ κύτταρα. Μετά από μια σχετικά εκτεταμένη αναζήτηση βρήκαμε ότι ένα μετάγραφο που αντιστοιχεί στο γονίδιο SLP-65 εκφράζεται σε πολύ μεγαλύτερο βαθμό στα άνεργα F5/ΝΡ CD8 Τ κύτταρα σε σχέση με τα παρθένα F5. Περαιτέρω, θελήσαμε να μελετήσουμε το ρόλο των πρωτεϊνών TNF και Fas τηςTNF/ΤΝFR υπεροικογένειας στο προσαρμόσιμο ανοσοποιητικό σύστημα και συγκεκριμένα στα CD8 Τ κύτταρα. Έτσι χρησιμοποιώντας τα παραπάνω συστήματα διαγονιδιακών ποντικιών σε συνδυασμό με ποντίκια με ανενεργό το tnf ή fas γονίδιο μελετήσαμε την επίδραση του TNF και του Fas στις κλωνοτυπκές αποκρίσεις των CD8 Τ κυττάρων σε αντιγόνα αλλά και τη συνεισφορά τους στην επιβίωση και εν γένει στην ομοιόσταση των CD8 Τ κυττάρων. Συγκεκριμένα, δείξαμε ότι η ανυπαρξία ενδογενούς TNF έχει σαν αποτέλεσμα μειωμένους αριθμούς περιφερικών F5 κυττάρων καθώς και ελαττωμένη ικανότητα τους για ομοιοστατικό πολλαπλασιασμό μετά από μεταφορά τους σε λεμφοπενικούς αποδέκτες. Μάλιστα αυτή η ικανότητα επηρεάζεται από την ικανότητα έκφρασης TNF από τα Τ λεμφοκύτταρα και όχι από τον αποδέκτη. Επιπλέον, δείξαμε ότι τα F5/TNF-/- CD8 Τ κύτταρα αποκρίνονται σε μικρότερο βαθμό στο αντιγόνο τόσο in vitro όσο και in vivo σε σχέση με F5, δηλαδή διαιρούνται με μικρότερο ρυθμό και εκφράζουν σε χαμηλότερο βαθμό χαρακτηριστικούς επιφανειακούς μάρτυρες ενεργοποίησης. Αυτή η μειωμένη ενεργοποίηση των F5/TNF-/-Τ κυττάρων συνοδεύεται και από μειωμένο αποπτωτικό θάνατο που επάγεται από την ενεργοποίηση τους (AICD). Η επίδραση της TNF μεταλλαγής δεν περιορίζεται στον F5 κλώνο καθώς και TNF-/-Τ κύτταρα έχουν μειωμένη ικανότητα πολλαπλασιασμού και αποπτωτικού θανάτου όταν διεγερθούν πολυκλωνικώς με a-CD3. Οι ελαττωματικές αποκρίσεις των TNF-/-Τ κυττάρων μετά από διέγερση του TCR συνδέονται με τη μειωμένη ενεργοποίηση των μεταγραφικών παραγόντων ΝF-κB και ΝF-AΤp που ανιχνεύσαμε σε F5/TNF-/-κύτταρα. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι ο TNF έχει έναν σημαντικό ρόλο στην περιφερική ανοχή των CD8 Τ λεμφοκυττάρων. Ειδικότερα, παρουσιάζεται μειωμένη κλωνική απαλοιφή των εν δυνάμει αυτοδραστικών F5/ΝΡΤ κυττάρων στο TNF-/- υπόβαθρο. Επιπλέον τα F5/ΝΡ/TNF-/- CD8+Τ κύτταρα έχουν σημαντικά αυξημένη δραστικότητα σε επαναδιέγερσή τους με αντιγόνο in vitro σε σχέση με τα ομόλογά τους από F5/ΝΡ ζώα. Επιβεβαιωτικά, σε πειράματα μεταφοράς παρθένων F5 κυττάρων σε ΝΡ αποδέκτες παρουσία ή απουσία TNF, η επαγωγή ανέργειας ήταν λιγότερο αποτελεσματική στη δεύτερη περίπτωση. Συνολικά λοιπόν τα πειραματικά μας δεδομένα δείχνουν ότι ο ενδογενής TNF μπορεί να διαμορφώνει μια πλειάδα λειτουργιών των CD8 Τ κυττάρων και αυτό οφείλεται στο ότι ενισχύει την TCR σηματοδότηση τόσο για συνδέτες χαμηλής όσο και για συνδέτες υψηλής συγγένειας. Τα πειράματά μας με lpr ποντίκια (μεταλλαγή που καθιστά ανενεργό το γονίδιο fas) έδειξαν ότι ο Fas έχει έναν ρόλο, αν και μικρό, στην συντήρηση του φυσιολογικού αριθμού περιφερικών F5 CD8 Τ κυττάρων σε νεαρά ποντίκια και μάλιστα η σύγχρονη έλλειψη TNF και Fas δρα προσθετικά στην μείωση των περιφερικών F5 CD8 Τ λεμφοκυττάρων. Η έλλειψη του Fas, δεν επηρεάζει τον αποπτωτικό θάνατο που επάγεται από ενεργοποίηση στα F5 Τ κύτταρα in vivo όπως έδειξαν πειράματα μεταφοράς λεμφοκυττάρων σε ΝΡ αποδέκτες. Μάλιστα δεν γίνεται ορατός κάποιος ρόλος του Fas στον θάνατο αυτό ακόμα και όταν ελλείπει συγχρόνως και ο TNF. Επίσης, ο ενδογενής Fas δεν έχει κάποιο εμφανή ρόλο στην κλωνική απαλοιφή των F5/ΝΡ CD8 Τ κυττάρων αλλά ούτε και στον άνεργο φαινότυπο των εναπομεινάντων κυττάρων.