Ανάπτυξη νέων αναλυτικών μεθόδων προσδιορισμού θειολών σε τρόφιμα και βιολογικά δείγματα με σύζευξη της υγρής χρωματογραφίας με αυτοματοποιημένα συστήματα ροής

Abstract

In summary, the experimental data of the present Dissertation lead to the following:The first study reports the very first application of ethyl propiolate (EP) as anadvantageous pre-column derivatization reagent for the determination of cysteine,glutathione and N-acetylcysteine by liquid chromatography. These thiols werederivatized online under stopped-flow conditions in a sequential injection systemcoupled to liquid chromatography. The reaction was rapidly allowed to proceed understopped-flow conditions in the loop of the LC setup. The formed derivatives wereseparated isocratically using a monolithic stationary phase and were detectedspectrophotometrically at 285 nm. Critical parameters that affected the online precolumnderivatization reaction (e.g. the reaction time and the amount concentration ofEP) and the separation (e.g. pH and the composition of the mobile phase) wereinvestigated. The developed analytical scheme offers a total analysis time of less than10 min. The limits of detection were in the range of 0.24–0.40 × 10-3 mol L-1and thelinearity achieved were up to 200 × 10-3 mol L-1for all analytes. The proposed methodwas satisfactorily applied to the analysis of the selected thiols – that are oftenemployed as antibrowning agents – in fresh fruit samples.The second study reports a new High Performance liquid chromatographic (HPLC)method for the determination of the anti-hypertension drug captopril in human urine.After its separation from the sample matrix in a reversed phase HPLC column,captopril reacts with the thiol-selective reagent ethyl-propiolate (EP) in a postcolumnconfiguration (PCD) and the formed thioacrylate derivative is detectedspectrophotometrically at 285 nm. Automated 4-fold preconcentration of the analyteprior to analysis was achieved by an on - line solid phase extraction (SPE) step usinga Sequential Injection (SI) manifold. The Oasis HLB SPE cartridges offeredquantitative recoveries and effective sample cleaning by applying a simple SPEprotocol. The limits of detection and quantitation were 10 μg L-1and 35 μg L-1respectively. The percent recoveries for the analysis of human urine samples rangedamong 90 – 96 % and 95 – 104 % using aqueous and matrix matched calibrationcurves respectively. The features of the developed method are as follows: i) it is moresensitive and simple compared to the only previously reported PCD method; ii) thesample preparation and analysis steps are fully automated by coupling SI and HPLC; iii) the Oasis HLB SPE cartridges offer quantitative recoveries of the analyte from thebiological matrix, preconcentration potentials and adequate capacity and stability; iv)EP is an excellent reagent for captopril in terms of sensitivity and rapid reaction underflow conditions; (v) the method is capable of determining total captopril since theexcess of the reducing reagent does not interfere in the PCD mode.Finally the last work reports one of the very first applications of on-line post-columnderivatization to hydrophilic interaction chromatography, offering a viable tool for thedetermination of low molecular weight thiolic compounds. More specifically itproposes a new method for the determination of Glutathione and Cysteine in yeastsamples. The analytes were separated isocratically from the sample matrix byHydrophilic Interaction Chromatography (HILIC) and they were detectedspectrophotometrically at 285 nm following on-line post-column derivatization (PCD)by the thiol-selective reagent methyl-propiolate in alkaline medium. The method takesadvantage of the ability of HILIC to retain polar analytes and the well-establishedpotentials of post-column derivatization to the analysis of complicated matriceswithout matrix effects. The main figures of merit included linearity in the range of 5 –200.0 × 10-6 mol L-1and a limit of detection 0.6 × 10-6 mol L-1for both compounds.The absence of matrix effect allowed the determination of cysteine and glutathione invarious yeast samples. Glutathione was present in most of the samples at levelsranging among 0.9 – 3.1 mg g-1, whereas Cysteine was determined in only one sampleat significantly lower concentration. In terms of accuracy, the percent recoveriesranged among 91.2 to 105.6 % for glutathione and 91.6 to 106.9 % for cysteine.

Συνοψίζοντας, τα πειραματικά δεδομένα της Διδακτορικής Διατριβής προκύπτουν ταπαρακάτω:1) Στην πρώτη πειραματική εργασία προτείνεται μια νέα φασματοφωτομετρικήμέθοδος ταυτόχρονου προσδιορισμού τριών θειολών, της κυστεΐνης, τηςγλουταθειόνης και της Ν-ακελυτοκυστεΐνης σε φρούτα. Η ανάπτυξη της μεθόδουπραγματοποιήθηκε με σύζευξη δύο επιμέρους αναλυτικών τεχνικών, της Τεχνικήςτων Διαδοχικών Εγχύσεων και της Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Απόδοσης.Χαρακτηριστικό της μεθόδου είναι η πλήρης αυτοματοποίηση του συζευγμένουσυστήματος και η δυνατότητα ανεξάρτητης λειτουργίας και ελέγχου των επιμέρουςδιατάξεων από ηλεκτρονικό υπολογιστή. Στην προτεινόμενη μέθοδο γίνεται χρήσηγια πρώτη φορά των άλκυλο εστέρων του προπιολικού οξέως για τηνπαραγωγοποίηση θειολών, πριν τον διαχωρισμό τους σε χρωματογραφική στήλη. Μετην Τεχνική των Διαδοχικών Εγχύσεων επιτυγχάνεται η εν-ροή προσθήκη τωνδειγμάτων και του αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης, ενώ με την ΥγρήΧρωματογραφία πραγματοποιείται ο διαχωρισμός των σχηματιζόμενων παραγώγωνμε τη χρήση μονολιθικής χρωματογραφικής στήλης αντίστροφης φάσης υπόισοκρατικές συνθήκες έκλουσης. Η εν ροή αντίδραση των τριών θειολών με τααντιδραστήρια παραγωγοποίησης μεθυλικός εστέρας του προπιολικού οξέος καιαιθυλικός εστέρας του προπιολικού οξέος πραγματοποιείται σε καναλικό σύστημα, τοοποίο παράλληλα χρησιμεύει για τη σύζευξη των δυο οργανολογικών διατάξεων. Ηχρήση μονολιθικής στήλης επιτρέπει την ταχεία έκλουση των παραγώγων και οδηγείσε υψηλούς ρυθμούς δειγματοληψίας. Η ανίχνευση πραγματοποιείταιφασματοφωτομετρικά στα 285 nm. Η προτεινόμενη μέθοδος επικυρώθηκε ως προς τηγραμμικότητα (έως 200 × 10-6 mol L-1), τα όρια ανίχνευσης (0,24 – 0,40 μmol L-1),ποσοτικού προσδιορισμού, την ακρίβεια, την εκλεκτικότητα και εφαρμόστηκε μεεπιτυχία για τον προσδιορισμό των τριών θειολών και την παρακολούθηση τουρυθμού κατανάλωσής στους σε φρούτα.2) Στη δεύτερη πειραματική εργασία προτείνεται μια νέα χρωματογραφική μέθοδοςγια τον προσδιορισμό της καπτοπρίλης σε βιολογικά δείγματα. Η αναλυτικήδιαδικασία χωρίζεται σε τρία μέρη. Κατά το πρώτο μέρος πραγματοποιείται αυτοματοποιημένα, με τη βοήθεια της Τεχνικής των Διαδοχικών Εγχύσεων, εκχύλισηκαι προσυγκέντρωση του αναλύτη με χρήση μικροστηλών εκχύλισης στερεής φάσηςOASIS HLB. Στη συνέχεια, διαμέσου της βαλβίδας πολλαπλής επιλογής, η θειόληπροωθείται στο βρόγχο της βαλβίδας έγχυσης της χρωματογραφίας, εγχύεται σεαναλυτική στήλη αντίστροφης φάση και διαχωρίζεται από τα λοιπά συστατικά τουυποστρώματος υπό ισοκρατικές συνθήκες έκλουσης. Τέλος, μετά την έξοδό της απότη στήλη, η καπτοπρίλη συναντά τα αντιδραστήρια παραγωγοποίησης μεθυλικόςεστέρας του προπιολικού οξέος ή αιθυλικός εστέρας του προπιολικού οξέος σε ρεύμασυνεχούς ροής, όπου και πραγματοποιείται εν ροή η αντίδραση παραγωγοποίησης. Τοτελικά σχηματιζόμενο προϊόν οδηγείται σε φασματοφωτομετρικό ανιχνευτή, όπου καιανιχνεύεται. Όμοια με την προηγούμενη μέθοδο οι δύο διατάξεις λειτουργούνανεξάρτητα η μία από την άλλη και ελέγχονται από ηλεκτρονικό υπολογιστή. Ηπροτεινόμενη μέθοδος δίνει τη δυνατότητα προσδιορισμού όχι μόνο της ανηγμένηςμορφής της καπτοπρίλης, αλλά και της συνολικής της ποσότητας, καθώς η παρουσίααναγωγικών αντιδραστηρίων στο μίγμα που εγχύεται στη στήλη δεν επηρεάζει τηναντίδραση παραγωγοποίησης. Σε σύγκριση με παλαιότερες μεθόδους προσδιορισμούτης καπτοπρίλης μετά από παραγωγοποίηση η προτεινόμενη μέθοδος πλεονεκτεί ωςπρος την ευαισθησία για την εφαρμογή της σε δείγματα ούρων και την απλότητα πουτης χαρίζει ο αυτοματοποιημένος χαρακτήρας της. Η προτεινόμενη μέθοδοςεπικυρώθηκε ως προς τη γραμμικότητα (150 μg L-1- 2500 μg L-1), τα όριαανίχνευσης και ποσοτικού προσδιορισμού (10 μg L-1και 35 μg L-1αντίστοιχα), τηνακρίβεια και την εκλεκτικότητα και εφαρμόστηκε με επιτυχία στον προσδιορισμόκαπτοπρίλης σε δείγματα ούρων.3) Στην τρίτη πειραματική εργασία προτείνεται μια νέα φασματοφωτομετρικήμέθοδος για τον προσδιορισμό γλουταθειόνης και κυστεΐνης σε δείγματα μαγιάς.Αρχικά πραγματοποιήθηκε ο χρωματογραφικός διαχωρισμός των δύο θειολών μεχρήση χρωματογραφικής στήλης υδρόφιλων αλληλεπιδράσεων και στη συνέχεις οιθειόλες παραγωγοποιήθηκαν εν-ροή με τον μεθυλικό εστέρα του προπιολικού οξέος.Τα τελικά σχηματιζόμενα παράγωγα ανιχνεύθηκαν στα 285 nm. Η μέθοδος είναισύμφωνα με τη βιβλιογραφία μια από τις πρώτες μεθόδους που πραγματοποιείαντίδραση παραγωγοποίησης μετά από χρωματογραφικό διαχωρισμό σε σύστημαυδρόφιλων αλληλεπιδράσεων. Από τη μια η ικανότητα της Υγρής ΧρωματογραφίαςΥδρόφιλων Αλληλεπιδράσεων να συγκρατεί ικανοποιητικά και να διαχωρίζει πολικέςενώσεις και από την άλλη η αύξηση της ευαισθησίας ως αποτέλεσμα τωναντιδράσεων παραγωγοποίησης μετά τη χρωματογραφική στήλη προσέφεραν τηδυνατότητα ανάλυσης των δειγμάτων χωρίς επιδράσεις λόγω του υποστρώματος. Ηπροτεινόμενη μέθοδος επικυρώθηκε ως προς τη γραμμικότητα (έως και 200 μg L-1), αόρια ανίχνευσης και ποσοτικού προσδιορισμού 0,6 × 10-6 mol L-1και 2,0 × 10-6 mol L-1αντίστοιχα), την ακρίβεια και την εκλεκτικότητα και εφαρμόστηκε με επιτυχίαστον προσδιορισμό γλουταθειόνης και κυστεΐνης σε δείγματα μαγιάς.