Εφαρμογή της πρωτεωμικής στην ανίχνευση ανωμαλιών των χρωμοσωμάτων του φύλου στο αμνιακό υγρό και το περιφερικό αίμα εγκύου

Abstract

Medical advances in obstetrics and genetics provide the possibility of examination of the embryo for genetic abnormalities during gestation by use of techniques which have low but substantial risk for the pregnancy and the pregnant itself.Non invasive prenatal diagnosis techniques, mainly biochemical markers and ultrasonographic tests lack specificity, thus cannot be directly linked to a specific chromosomal abnormality, while they have a 5% chance of false positive result. Proteomic analysis (Proteomics) is a prominent new technology in the field of molecular medicine which, in combination with newly found sciences such as bioinformatics, has the potential to revolutionize the area of prenatal diagnostics. Examination methods that involve proteomic analysis are thought to drastically change the way diagnosis and treatment are performed in cases of many diseases. Proteomics focuses on the quantitative and qualitative analysis of the “proteome”, the sum of proteins of an organism at any given time, in order to investigate in deep biological functions and procedures.The present study involves the proteome analysis of amniotic fluid and plasma of 2nd trimester pregnancies in gestations of embryos with sex chromosomal abnormalities and the identification of biomarkers specific for each syndrome, in order to advance prognosis, diagnosis and treatment of each abnormality. Proteomic analysis was carried out by two dimensional gel electrophoresis and identification of protein spots was further performed by mass spectrometry. Proteins which were found to be differentially expressed between syndrome cases and control samples were further quantified by western blot analysis.Forty five amniotic fluid samples and 30 plasma samples of pregnant women in the 2nd trimester of pregnancy were analyzed in total:A. Fifteen amniotic fluid samples from pregnancies which was shown by routine cytogentic analysis that carried embryos with sex chromosome abnormalities, 6 were from Turner syndrome embyos (45, X0 caryotype), 5 from Klinefelter syndrome embryos (47, XXY caryotype) and 3 from 47, XXX caryotype.B. Thirty amniotic fluid samples from pregnancies with normal karyotype embryos. Fifteen normal male embryos (46, XY) and 15 with normal female embryos (46,XX), which were used as study controls.C. Ten plasma samples coming from pregnant carrying embryos with sex chromosomal abnormalities. Seven were pregnants carrying Turner syndrome embryos and 3 from pregnants carrying Klinefelter syndrome embryos.D. Twenty plasma samples from healthy uncomplicated 2nd trimester pregnancies that was known by routine cytogenetic analysis that carried normal karyotype embryos. 10 carrying healthy male embryos (46,XY) and 10 healthy female embryos (46,XX), that were used as study controls.As compared to controls, 7 proteins (TRFE, RETBP, LUM, APOA1, KNG, THBR, ApoA4) were found to be differentially expressed in amniotic fluid of Turner syndrome embryos, 7 proteins (CER, A1AT, ZA2G, APOA1, RETBP, GELS, VTDB) in amniotic fluid of Klinefelter syndrome embryos and 12 proteins (PAEP, VTDB, CYTC, AMBP, KAC, IBP1, CFAB, A1AT, TRFE, KNG, PRL, CSH) in amniotic fluid of 47, XXX embryos.Furthermore as compared to controls 16 proteins (CO3, HPT, SHBG, CD5L, HABP2, HBB, KAC, AFAM, C1S, A1BG, LAC, KNG, CLUS, IGHA1, IGJ, FIBG) were found to be differentially expressed in the plasma samples of pregnant women carrying Turner syndrome embryos and 5 proteins (FCN3, APOA4, APOE, APOH, TTR) in plasma samples of pregnats carrying Klinefelter syndrome embryos.This study, announces the dominant role of the proteomic technologies in the discovery of biomarkers concerning high risk pregnancies for chromosomal abnormalities. Even more it states the functionality of these techniques for the identification and study of proteins which are tightly correlated with the phenotypic characteristics of the sex chromosome abnormality syndromes.

H πρόοδος της μαιευτικής και της γενετικής δίνει τη δυνατότητα να ελεγχθεί το έμβρυο κατά τη διάρκεια της κύησης για ορισμένες γενετικές ανωμαλίες, μέσω τεχνικών οι οποίες είναι επεμβατικές και έχουν μικρό μεν αλλά υπαρκτό κίνδυνο γα το έμβρυο και την κύηση. Οι μη επεμβατικές μέθοδοι προγεννητικού ελέγχου, κατά κύριο λόγο οι βιοχημικοί δείκτες και το υπερηχογράφημα, αφενός μεν δεν είναι ειδικές, δηλαδή δεν συνδέονται με κάποιο συγκεκριμένο τύπο χρωμοσωμικής ανωμαλίας αφ’ ετέρου έχουν πιθανότητα 5% ψευδώς θετικού αποτελέσματος. Η πρωτεωμική ανάλυση (proteomics) φαίνεται ότι δίνει νέες προοπτικές στην μοριακή ιατρική και έχει την δυνατότητα να προκαλέσει επανάσταση στον τομέα του προγεννητικού ελέγχου συνδυαζόμενη με μεθόδους βιοπληροφορικής. Η ανάπτυξη τέτοιων μεθόδων πιστεύεται ότι θα αλλάξει δραματικά τον τρόπο διάγνωσης και θεραπευτικής αντιμετώπισης διαφόρων παθολογικών καταστάσεων. Η πρωτεωμική επιτρέπει την ποιοτική και ποσοτική ανάλυση των πρωτεωμάτων, του συνόλου δηλαδή των πρωτεϊνών ενός οργανισμού, κάτω από διαφορετικές συνθήκες, με σκοπό τη διερεύνηση βιολογικών διεργασιών. Σκοπός της μελέτης είναι η ανάλυση του πρωτεώματος αμνιακού υγρού και περιφερικού αίματος εγκύων 2ου τριμήνου που κυοφορούσαν έμβρυα με ανωμαλίες των χρωμοσωμάτων του φύλου και η ταυτοποίηση πρωτεϊνών- δεικτών, ειδικών για την κάθε ανωμαλία που θα χρησιμεύσουν για την πρόγνωση, διάγνωση ή και θεραπεία του κάθε νοσήματος.Η πρωτεωμική μελέτη των δειγμάτων πραγματοποιήθηκε με ηλεκτροφόρηση δύο διαστάσεων και περεταίρω ταυτοποίηση με φασματογραφία μάζας. Οι πρωτεϊνικές διαφορές που προέκυψαν μετά από σύγκριση των πρωτεϊνικών προφίλ των παθολογικών και των φυσιολογικών δειγμάτων επιβεβαιώθηκαν με ανοσοαποτύπωση κατά Western. Μελετήθηκαν 45 δείγματα αμνιακού υγρού και 30 δείγματα περιφερικού αίματος εγκύων στο 2ο τρίμηνο της κύησης οι οποίες υποβλήθηκαν σε προγεννητικό έλεγχο για την ανίχνευση χρωμοσωμικών ανωμαλιών του εμβρύου. Ειδικότερα μελετήθηκαν:Α) Δέκα πέντε δείγματα αμνιακού υγρού από κυήσεις στις οποίες ο κλασικός προγεννητικός έλεγχος έδειξε ότι είχαν έμβρυο με αριθμητική ανωμαλία των χρωμοσωμάτων του φύλου, 6 με σύνδρομο Turner (45, ΧΟ), 5 με σύνδρομο Klinefelter (47, ΧΧΥ) και 4 με καρυότυπο 47, ΧΧΧ.Β) Τριάντα δείγματα αμνιακού υγρού από εγκύους στις οποίες ήταν γνωστό ότι το έμβρυο είχε φυσιολογικό καρυότυπο, 15 από κυήσεις με έμβρυο αγόρι (46, ΧΥ) και 15 από κυήσεις με έμβρυο κορίτσι (46, ΧΧ). Γ) Δέκα δείγματα περιφερικού αίματος από εγκύους στις οποίες ο προγεννητικός έλεγχος είχε δείξει ότι είχαν έμβρυα με ανωμαλία των χρωμοσωμάτων του φύλου, 7 είχαν έμβρυο με σύνδρομο Turner (45,ΧΟ) και 3 με σύνδρομο Klinefelter (47,ΧΧΥ).Δ) Είκοσι δείγματα περιφερικού αίματος από υγιείς εγκύους στο 2ο τρίμηνο της κύησης οι οποίες ήταν γνωστό από τον κλασικό κυτταρογενετικό έλεγχο ότι είχαν έμβρυο χωρίς εμφανή ανωμαλία των χρωμοσωμάτων, 10 είχαν έμβρυο αγόρι (46, ΧΥ) και 10 κορίτσι (46,ΧΧ). Τα αποτελέσματα της μελέτης έδειξαν ότι επτά πρωτεΐνες (TRFE, RETBP, LUM, APOA1, KNG, THBR, AΡΟA4) του αμνιακού υγρού εμβρύων με σύνδρομο Turner, επτά πρωτεΐνες (CER, A1AT, ZA2G, APOA1, RETBP, GELS, VTDB) του αμνιακού υγρού εμβρύων σύνδρομο Klinefelter και δώδεκα πρωτεΐνες (PAEP, VTDB, CYTC, AMBP, KAC, IBP1, CFAB, A1AT, TRFE, KNG, PRL, CSH) του αμνιακού υγρού εμβρύων με καρυότυπο 47, ΧΧΧ, βρεθήκαν να εκφράζονται διαφορετικά σε σχέση με τα δείγματα αμνιακού υγρού από κυήσεις με φυσιολογικά έμβρυα. Δέκα έξι πρωτεΐνες (CO3, HPT, SHBG, CD5L, HABP2, HBB, KAC, AFAM, C1S, A1BG, LAC, KNG, CLUS, IGHA1, IGJ, FIBG) του περιφερικού αίματος εγκύων που κυοφορούσαν έμβρυα με σύνδρομο Turner και πέντε πρωτεΐνες (FCN3, APOA4, APOE, APOH, TTR) του περιφερικού αίματος εγκύων που κυοφορούσαν έμβρυα με σύνδρομο Klinefelter είχαν διαφοροποιημένα επίπεδα έκφρασης όταν συγκρίθηκαν με φυσιολογικά δείγματα.Η παρούσα μελέτη επιβεβαιώνει τον εξέχοντα ρόλο που κατέχει η πρωτεωμική στην αποκάλυψη νέων δεικτών ανίχνευσης κυήσεων υψηλού κινδύνου για χρωμοσωμικές ανωμαλίες, όσο και την ταυτοποίηση πρωτεϊνών η δράση των οποίων πιθανώς συνδέεται με τις φαινοτυπικές εκδηλώσεις γενετικών συνδρόμων.