Συστηματική φλεγμονώδης αντίδραση σε πειραματικό μοντέλο πολυτραυματία: η θέση της θαλιδομίδης

Abstract

Introduction. Severe trauma is one of the main causes of the systemic inflammatory response syndrome (SIRS), potentially leading to clinical deterioration and patient death. The role of the immune system is central in the pathogenesis of SIRS. A variety of pro-inflammatory cytokines are secreted by immune cells in response to trauma, and their dysregulation may lead to SIRS and multiple organ dysfunction. Tumor necrosis factor-alpha (TNFα) is a central mediator of the immune response after trauma. It appears early in serum after the traumatic event, stimulates the production of other pro-inflammatory cytokines, primes loss of integrity of vascular endothelium and drives apoptosis of lymphocytes. Therefore TNFα is considered a major target for therapies aiming to modulate the host’s immune response. Developed immunomodulatory strategies so far comprise monoclonal antibodies targeting TNFα and soluble TNF receptors. These agents failed to show any survival benefit in clinical studies in patients with severe sepsis, probably indicating that strategies aiming to modulate excess production of TNFα require another approach. Thalidomide (a-N-phthalimidoglutarimide) was initially used as a sedative and antiemetic during pregnancy but it was withdrawn from the market due to its teratogenic effects. It is an immunomodulatory compound that selectively inhibits TNFα synthesis by reducing the half-life of mRNA in human monocytes. Thalidomide is160currently used for its anti-angiogenic and anti-TNF properties in the treatment of a variety of diseases like erythema nodosum leprosum, Crohn’s disease, multiple myeloma and HIV-related aphthous ulcers. In a previous study, thalidomide was administered orally to rats as pre-treatment for experimental sepsis. It prolonged survival and reduced circulating levels of TNFα. However, oral administration of the drug in shocked animals is not feasible. Therefore, an intravenous thalidomide formulation was prepared and administered for the management of lethal injury in an experimental study in rabbits.Materials and methods. Thirty white New Zealand male rabbits with mean (±SD) weight 3.37 ±0.35 kg were used in the study. Thalidomide is sparingly soluble in water and undergoes rapid spontaneous hydrolysis in the physiologic pH range. Therefore thalidomide solutions of 0.2 mg/mL, 0.5 mg/mL and 1 mg/mL in 5% Dextrose Water (DW) were produced following thalidomide complexation with (2-hydroxy-propyl)-β-cyclodextrin. Pharmacokinetics of the prepared solutions was established by intravenously administering them to six animals. Thalidomide concentrations in prepared solutions and animal sera were determined by a HPLC method. All prepared solutions were stable. Animals receiving the 1.0 mg/mL solution had mean (±SD) thalidomide serum concentrations of 7.30±1.50 μg/mL at the end of infusion and 5.82±1.45 μg/mL, 60 min post-infusion. Based on these results the 1 mg/mL solution was deemed appropriate for administration in the rest of the study. Following an open fracture of the right femur, 24 rabbits were assigned to groups A (controls) and B (thalidomide). Group A (n=14) were administered 30 ml of 5% DW within 15161minutes, starting 30 minutes after the femoral fracture. Group B (n=10) were administered 30 ml of the 1mg/mL prepared thalidomide solution in 5% DW within 15 minutes, starting 30 minutes after the femoral fracture. Hemodynamic monitoring was performed for 4 hours, survival was recorded and bacterial growth in organs was measured. Blood was sampled at time 0 and at 2, 4, 24 and 48h for TNFα measurement, isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and culture. TNFα was measured by a bioassay on the L929 fibrosarcoma cell line and apoptosis of PBMCs was measured by flow cytometry after staining with ANNEXIN-V and propidium iodide (PI). Cells staining positive for ANNEXIN-V and negative for PI were considered apoptotic. An ex-vivo experiment was performed incubating PBMCs from healthy animals and humans with sera from groups A and B sampled at 2h and 24h post injury and measuring induction of apoptosis as described above.Results. Survival of group B was considerably prolonged compared with group A (log rank = 5.543, p = 0.019). Clarification of the possible mechanism of action of thalidomide, was focused on an effect on i) animal hemodynamics; ii) tissue bacterial growth; iii) circulating TNFα; and iv) apoptosis of circulating mononuclear cells. No differences were found between groups A and B regarding systolic, diastolic and mean arterial pressures and heart rate showing that thalidomide was not acting on animal hemodynamics. In a similar fashion, all blood cultures in both groups were negative for bacterial growth and quantitative tissue cultures of spleen, liver and lung did not differ between group. Bacterial isolates were species of enterobacteriaceae. Circulating concentrations162of TNFα at baseline and at 2h and 4h after injury did not differ between the two groups. As a consequence, a hypothesis was generated that thalidomide exerted its effect via an immunomodulatory action that did not involve TNFα inhibition. To test this, the apoptotic rate of PBMCs between the two groups was compared. It became obvious that PBMC apoptosis was increased in the control group compared to the thalidomide group and this was significant at 2h and 24h after injury. The observation of decreased PBMC apoptosis among thalidomide-treated rabbits, elaborated the hypothesis that a circulating factor may exist, other than TNFα, that is responsible for this apoptosis modulation. To this end, serum from control and treated animals was incubated with PBMCs of healthy rabbits. Since differences in apoptosis of PBMCs were identified at 2h and 24h, it was considered that serum sampled at these time intervals should be applied for testing. Serum of treated animals sampled at 24h, i.e. long after the peak levels of thalidomide as defined by the preliminary pharmacokinetic analysis, induced apoptosis of lymphocytes. The possibility of an interspecies activity of the serum factor was examined. Human lymphocytes incubated with sera from both groups collected at 24h post injury did not show any difference in their early apoptotic rates.Conclusion. Intravenous thalidomide administration in an experimental model of lethal musculoskeletal injury in rabbits:1) Prolonged animal survival.2) Its mechanism of action did not involve TNFα suppression.1633) Exerted an immunomodulatory effect preventing apoptosis of PBMCs by inhibition of an unidentified serum factor.In view of these promising results, further research is needed to clarify the immunomodulatory mechanism of action of thalidomide and its potential use for the management of severe trauma.

Εισαγωγή. Οι σοβαρές τραυματικές κακώσεις αποτελούν μια από τις κύριες αιτίες του Συνδρόμου Συστηματικής Φλεγμονώδους Αντίδρασης (SIRS) με πιθανή κατάληξη την κλινική επιδείνωση και το θάνατο του ασθενούς. Ο ρόλος του ανοσοποιητικού συστήματος είναι κεντρικός στην παθογένεση του SIRS. Φλεγμονώδεις κυτταροκίνες εκκρίνονται από ποικίλα κύτταρα του ανοσοποιητικού και η διαταραχή της ρύθμισης τους μετά από βαρύ τραύμα μπορεί να καταλήξει σε SIRS και πολυοργανική ανεπάρκεια. O παράγοντας νεκρώσεως των όγκων-α (TNF-α), κατέχει έναν κεντρικό ρυθμιστικό ρόλο στην ανοσοαντίδραση μετά από βαρύ τραύμα. Εμφανίζεται πρώιμα στον ορό μετά από τον τραυματισμό, επάγει την παραγωγή άλλων φλεγμονωδών κυτταροκινών, προάγει την βλάβη του ενδοθηλίου και επάγει την απόπτωση των λεμφοκυττάρων. Κατά συνέπεια αποτελεί σημαντικό στόχο προσπαθειών τροποποίησης της ανοσοαντίδρασης. Οι μέχρι τώρα κλινικά εφαρμοσμένες στρατηγικές περιλαμβάνουν τη χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων που στοχεύουν τον TNFα και τους διαλυτούς υποδοχείς του. Οι παράγοντες όμως αυτοί, σε κλινικές μελέτες με σηπτικούς ασθενείς, έχουν αποδειχτεί αναποτελεσματικοί όσον αφορά στη βελτίωση της επιβίωσης των ασθενών. Αυτό πιθανά υποδεικνύει ότι απαιτείται μια διαφορετική προσέγγιση στις στρατηγικές τροποποίησης της υπερβολικής έκκρισης TNF-α. Η θαλιδομίδη (α-154N-φθαλιμιδογλουταριμίδη) χρησιμοποιήθηκε αρχικά ως ηρεμιστικό και αντιεμετικό φάρμακο κατά την εγκυμοσύνη, αλλά αποσύρθηκε από την αγορά λόγω της τερατογονικής δράσης της. Η θαλιδομίδη δρα ανοσοτροποποιητικά αναστέλλοντας εκλεκτικά τη σύνθεση του TNF-α, μέσω της μείωσης του χρόνου ημιζωής του mRNA του στα ανθρώπινα μονοκύτταρα, ενώ με άλλους μηχανισμούς αναστέλλει την αγγειογένεση. Λόγω αυτών των ιδιοτήτων της χρησιμοποιείται σήμερα στη θεραπεία διαφόρων νοσημάτων όπως το λεπρικό οζώδες ερύθημα, η νόσος του Crohn, το πολλαπλό μυέλωμα και η αφθώδης στοματίτιδα σε ασθενείς με λοιμώξεις HIV. Η από του στόματος χορήγηση θαλιδομίδης πριν την πρόκληση σήψης σε πειραματικό μοντέλο σε αρουραίους είχε ως αποτέλεσμα την βελτίωση της επιβίωσης των ζώων και την μείωση των επιπέδων TNF-α. Εν τούτοις, η από του στόματος χορήγηση της ουσίας σε ζώα που βρίσκονται σε καταπληξία δεν είναι δυνατή. Έτσι προχωρήσαμε στην παρασκευή ενός διαλύματος θαλιδομίδης κατάλληλου για ενδοφλέβια χορήγηση. Στη συνέχεια το χορηγήσαμε σε κονίκλους σε ένα πειραματικό μοντέλο θανατηφόρου τραύματος με σκοπό τη μελέτη της δράσης της θαλιδομίδης σε αυτό.Υλικά και μέθοδος. Στη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν 30 αρσενικοί λευκοί κόνικλοι Νέας Ζηλανδίας με μέσο (±SD) βάρος 3,37± 0,35 kg. Η θαλιδομίδη είναι δυσδιάλυτη στο νερό και σε φυσιολογικό pH υπόκειται σε ταχεία αυθόρμητη υδρόλυση. Έτσι παρασκευάστηκαν διαλύματα θαλιδομίδης σε 5% Dextrose Water (DW) με συγκεντρώσεις 0,2 mg/mL, 0,5 mg/mL και 1 mg/mL μετά από σύνδεση της θαλιδομίδης με (2-υδροξυπροπυλ)-β-κυκλοδεξτρίνη.155Πραγματοποιήθηκε μελέτη της φαρμακοκινητικής των παρασκευασθέντων διαλυμάτων θαλιδομίδης με ενδοφλέβια χορήγησή τους σε 6 ζώα. Η συγκέντρωση της θαλιδομίδης στα διαλύματα και στα δείγματα ορού των ζώων προσδιορίστηκε με τη χρήση μιας μεθόδου HPLC. Όλα τα διαλύματα ήταν σταθερά. Τα ζώα στα οποία χορηγήθηκε το διάλυμα θαλιδομίδης με συγκέντρωση 1 mg/mL είχαν μέση (±SD) συγκέντρωση θαλιδομίδης στον ορό 7,30±1,50 μg/mL κατά το τέλος της έγχυσης και 5,82±1,45 μg/mL, 60 min μετά το τέλος της. Με βάση αυτά τα δεδομένα το διάλυμα με συγκέντρωση 1 mg/mL θεωρήθηκε κατάλληλο για χρήση στην πειραματική μελέτη. Μετά από την πρόκληση ανοικτού κατάγματος του δεξιού μηριαίου 24 κόνικλοι χωρίστηκαν στις ομάδες A (ομάδα ελέγχου) και B (θαλιδομίδη). Τα ζώα της ομάδας A (n=14) έλαβαν, με ενδοφλέβια έγχυση διαρκείας 15 min, 30 ml 5% DW με έναρξη 30 min μετά το κάταγμα. Τα ζώα της ομάδας Β (n=10) έλαβαν, με ενδοφλέβια έγχυση διαρκείας 15 min, 30 ml του διαλύματος θαλιδομίδης 1mg/mL σε 5% DW με έναρξη 30 min μετά το κάταγμα. Τα ζωτικά σημεία των ζώων καταγράφονταν για 4 ώρες, ενώ επίσης καταγράφηκε η επιβίωσή τους και μελετήθηκε η βακτηριακή ανάπτυξη στα όργανα των νεκρών ζώων. Αιμοληψίες πραγματοποιήθηκαν κατά την ώρα 0 και στις 2, 4, 24 και 48h μετά το κάταγμα. Μετρήθηκαν τα επίπεδα TNF-α, απομονώθηκαν τα μονοκύτταρα και λεμφοκύτταρα (PBMC) και πραγματοποιήθηκαν αιμοκαλλιέργειες των δειγμάτων. Ο TNF-α μετρήθηκε με μια μέθοδο βιολογικού προσδιορισμού με χρήση της κυτταρικής σειράς ινοσαρκώματος L929 και η απόπτωση των PBMC με κυτταρομετρία ροής μετά από χρώση τους με ανεξίνη-V και ιωδιούχο προπίδιο.156Τα κύτταρα που βρίσκονταν θετικά για ανεξίνη-V και αρνητικά για PI κατά την κυτταρομετρία ροής θεωρούνταν αποπτωτικά. Πραγματοποιήθηκε επίσης ένα ex-vivo πείραμα, όπου επωάστηκαν PBMC από υγιή ζώα και εθελοντές με ορούς των ομάδων A και B που συλλέχθηκαν 2h και 24h μετά το κάταγμα και ακολούθησε η μέτρηση της απόπτωσής τους όπως περιγράφηκε πιο πάνω.Αποτελέσματα. Η επιβίωση των ζώων στην ομάδα B ήταν σημαντικά μεγαλύτερη σε σχέση με αυτών της ομάδας A (log rank = 5.543, p = 0.019). Η διασαφήνιση του πιθανού μηχανισμού δράσης της θαλιδομίδης εστιάστηκε στην επίδραση της α) στις αιμοδυναμικές παραμέτρους των ζώων, β) στο βακτηριακό φορτίο των οργάνων των ζώων , γ) στα επίπεδα του TNF-α στον ορό των ζώων και δ) στην απόπτωση των λεμφοκυττάρων και μονοκυττάρων των ζώων. Δεν βρέθηκαν διαφορές μεταξύ των ομάδων Α και B όσον αφορά στην συστολική, διαστολική και μέση αρτηριακή πίεση και στην καρδιακή συχνότητα. Αυτό οδηγεί στο συμπέρασμα ότι η θαλιδομίδη δεν επέδρασε στις αιμοδυναμικές παραμέτρους των ζώων. Όλες οι αιμοκαλλιέργειες ήταν αρνητικές και οι ποσοτικές καλλιέργειες των ιστών δεν διέφεραν μεταξύ των δυο ομάδων. Οι απομονωθέντες μικροοργανισμοί ήταν στελέχη εντεροβακτηριοειδών. Οι συγκεντρώσεις του TNF-α στον ορό δεν διάφεραν μεταξύ των δύο ομάδων τόσο κατά την ώρα 0 όσο και 2h και 4h μετά το κάταγμα. Κατά συνέπεια σχηματίστηκε η υπόθεση ότι η θαλιδομίδη δρούσε μέσω ενός ανοσοτροποποιητικού μηχανισμού που δεν περιελάμβανε την αναστολή του TNF-α. Για να εξετάσουμε την υπόθεση αυτή συγκρίθηκε ο ρυθμός απόπτωσης των PBMC μεταξύ των δύο ομάδων. Έγινε εμφανές ότι η απόπτωση των PBMC ήταν αυξημένη στην ομάδα157ελέγχου σε σχάση με την ομάδα της θαλιδομίδης, η διαφορά αυτή δε ήταν στατιστικά σημαντική στις 2h και 24h μετά την κάκωση. Η παρατήρηση μειωμένης απόπτωσης των PBMC στα ζώα που έλαβαν θαλιδομίδη, οδήγησε στο σχηματισμό της υπόθεσης της ύπαρξης ενός άγνωστου παράγοντα στον ορό, διαφορετικού από τον TNF-α. Σύμφωνα με την υπόθεση, ο άγνωστος αυτός παράγοντας είναι υπεύθυνος για την τροποποίηση της απόπτωσης. Για να επιβεβαιώσουμε την υπόθεση αυτή οροί από τις ομάδες ελέγχου και θαλιδομίδης επωάστηκαν με PBMC υγιών κονίκλων. Εφόσον οι διαφορές στην απόπτωση των PBMC εντοπίστηκαν κυρίως στις 2h και 24h, θεωρήθηκε ότι έπρεπε να χρησιμοποιηθούν οροί που συλλέχτηκαν σ’ αυτές τις χρονικές στιγμές. Ο ορός των ζώων που έλαβαν θαλιδομίδη και που συλλέχθηκε 24h μετά την κάκωση, δηλ. πολύ αργότερα από την επίτευξη των κορυφαίων συγκεντρώσεων θαλιδομίδης, προκάλεσε επαγωγή της απόπτωσης των λεμφοκυττάρων. Εξετάστηκε επίσης η πιθανότητα ο άγνωστος αυτός παράγοντας να έχει δραστικότητα μεταξύ-των-ειδών. Ανθρώπεια λεμφοκύτταρα επωάστηκαν με ορούς που συλλέχτηκαν από ζώα των δυο πειραματικών ομάδων 24 ώρες μετά την κάκωση και στη συνέχεια προσδιορίστηκε το ποσοστό απόπτωσης τους. Δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στην απόπτωση μεταξύ των δύο ομάδων.Συμπέρασμα. Σε πειραματικό μοντέλο θανατηφτραύματος του μυοσκελετικού σε κονίκλους η ενδοφλέβια χορήγηση θαλιδομίδης:1. Βελτιώνει την επιβίωση των πειραματοζώων.2. Δεν επηρεάζει τα επίπεδα TNF-α στον ορό των ζώων1583. Δρα ανοσοτροποποιητικά μειώνοντας την απόπτωση των μονοκυττάρων και λεμφοκυττάρων του αίματος των ζώων, μέσω πιθανής αναστολής ενός άγνωστου παράγοντα στον ορό.Με βάση τα ενθαρρυντικά αυτά αποτελέσματα πιστεύουμε ότι χρειάζεται περαιτέρω μελέτη για τη διακρίβωση του ακριβούς μηχανισμού δράσης της θαλιδομίδης και τη δυνητική χρήση της στην αντιμετώπιση ασθενών με βαρύ τραύμα