Συγκριτική μελέτη μεθόδων ανίχνευσης ολιγοκλωνικών δεσμών στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό

Abstract

Analysis of cerebrospinal fluid (CSF) proteins is useful in the detection of inflammatory conditions where intrathecal synthesis of immunoglobulins take place. Multiple sclerosis (MS) is an inflammatory disorder of the brain and spinal cord in which focal lymphocytic infiltration leads to damage of myelin and axons. Patients with multiple sclerosis and other demyelinating disorders, such as Subacute Sclerosing Panencephalitis, neurosyphilis, neuro-Lyme disease, cysticercosis, Systemic Lupus Erythematosus often have elevated cerebrospinal fluid (CSF) IgG concentrations due to intrathecal synthesis.Quantitatively this can be investigated with the aid of IgG index, which is the ratio of IgG concentration in the CSF-serum to albumin concentration in the CSF-serum. The IgG index reference range is 0,3 to 0,7. It is elevated in about 70% of MS patients. Qualitatively one of the best methods to detect intrathecal IgG synthesis has been to examine CSF for the presence of oligoclonal bands (OCBs) after separation of proteins by electrophoresis. IgG in normal CSF migrates as a faint diffuse zone, but in demyelinating diseases IgG migrates as discrete oligoclonal bands. Two or more IgG bands in CSF that are not detectable in corresponding serum reflect a local B-cell response accompanying Central Nervous System (CNS) inflammation. The gold standard method of demonstrating OCBs is thought to be electrophoresis of paired serum and CSF samples with isoelectric focusing (IEF) followed by immunofixation. However this method has not been adopted by many laboratories demanding a lot of time and effort.The purpose of this study was to compare the gold standard method of IEF followed by immunofixation with a commercially available technique which is semi-automated, which uses high-resolution agarose gel electrophoresis (HRAGE) directly followed by immunofixation with a peroxidase-labeled anti-IgG antiserum to detect OCBs. Additionally IgG index was calculated and compared to the results of the two quantitative methods. Paired serum and CSF samples collected from 225 patients admitted to the Department of Neurology, Athens General Hospital "G. Gennimatas" during a period of thirty six months, with the clinical suspicion of multiple sclerosis were studied for the presence of oligoclonal bands.Isoelectric focusing with IgG immunofixation was performed according to Keir and al. High-resolution agarose gel electrophoresis (HRAGE) followed by immunofixation was performed at the HYDRASYS System apparatus (SEBIA) according to the instructions of the manufacturer. The IgG index was calculated according to the type (IgGCSF/IgGserum) / (AlbumineCSF/Albumineserum). Albumine and IgG were measured using nephelometry. Values higher than 0,7 were considered positive.The agreement between the two methods (HRAGE and IEF) was 98.7% and kappa index was 0.97 (p<0.001) indicating excellent agreement between the two methods. Considering IEF as the gold standard method, among the 91 samples found to be positive with that method, 88 were also identified to be positive with HRAGE. The agreement between HRAGE and IgG index was 84.0% and kappa index was 0.65 (p<0.001) indicating good agreement between IgG index calculating and HRAGE. From the 72 samples that were classified as positive depending on the IgG index, 62 were positive with the HRAGE method. Among the patients with normal IgG index values, 28 had OBs in their CSF. On the other hand, 9 patients with elevated IgG index values, where negative for OBs.One can conclude that when CSF testing for the detection of OBs is considered necessary the semi-automated commercially available technique, which uses high-resolution agarose gel electrophoresis (HRAGE) directly followed by immunofixation with a peroxidase-labeled anti-IgG antiserum can sufficiently replace the more laborious and time consuming gold standard technique of IEF. The lower count of bands derived with the HRAGE technique, though, could affect the results in challenging situations. The quantitative IgG index cannot replace the qualitative procedures, but can become an informative, useful tool in several courses.

Η ανάλυση των πρωτεϊνών του εγκεφαλονωτιαίου υγρού είναι χρήσιμη στη διερεύνηση φλεγμονωδών νοσημάτων, όπου λαμβάνει χώρα ενδοθηκική σύνθεση ανοσοσφαιρινών. Η Σκλήρυνση Κατά Πλάκας είναι νόσημα του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος (εγκέφαλος και νωτιαίος μυελός), πιθανότατα αυτοάνοσης αιτιολογίας, κατά το οποίο το ανοσοποιητικό σύστημα του οργανισμού στρέφεται έναντι αντιγόνων της μυελίνης ουσίας. Η νόσος, επομένως, χαρακτηρίζεται από φλεγμονή και απομυελίνωση. Πάσχοντες από Σκλήρυνση Κατά Πλάκας, αλλά και από άλλα νοσήματα, όπως ο Συστηματικός Ερυθηματώδης Λύκος, η νευροσύφιλη, η Υποξεία Σκληρυντική Πανεγκεφαλίτιδα, εμφανίζουν συχνά αυξημένες συγκεντρώσεις ανοσοσφαιρινών στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό, λόγω ενδοθηκικής σύνθεσης.Ποσοτικά, το γεγονός αυτό μπορεί να αποτυπωθεί με τη βοήθεια του δείκτη IgG, που αποτελεί τον λόγο (IgG ΕΝΥ/ IgG ορού) / (αλβουμίνη ΕΝΥ/ αλβουμίνη ορού). Οι τιμές αναφοράς του λόγου κυμαίνονται από 0,3 έως 0,7. Η τιμή του είναι αυξημένη σε ποσοστό περίπου 70% των πασχόντων από Σκλήρυνση Κατά Πλάκας. Ποιοτικά, από τις καλύτερες μεθόδους ανάδειξης της ενδοθηκικής παραγωγής IgG είναι η εξέταση του ΕΝΥ για την παρουσία ολιγοκλωνικών ζωνών, μετά από διαχωρισμό των πρωτεϊνικών κλασμάτων με τη βοήθεια της ηλεκτροφόρησης. Στην περίπτωση της ΣΚΠ, η IgG δεν αποτυπώνεται ως διάχυτη ζώνη στην ηλεκτροφόρηση του ΕΝΥ, όπως συμβαίνει φυσιολογικά, αλλά δημιουργεί ολιγάριθμες, ευδιάκριτες ζώνες. Η παρουσία στο ΕΝΥ δύο ή περισσότερων ζωνών που απουσιάζουν από το αντίστοιχο δείγμα του ορού, είναι ενδεικτική διέγερσης περιορισμένου κλώνου λεμφοκυττάρων. Η μέθοδος αναφοράς για την αναζήτηση των ολιγοκλωνικών ζωνών με βάση τη διεθνή βιβλιογραφία, είναι η ισοηλεκτρική εστίαση ακολουθούμενη από ανοσοαποτύπωση. Δεν εφαρμόζεται όμως από την πλειοψηφία των εργαστηρίων, καθώς είναι μέθοδος απαιτητική, χρονοβόρα, και με δυσκολία προτυποποίησης.Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η σύγκριση δύο μεθόδων για την αναζήτηση ολιγοκλωνικών ζωνών, της ισοηλεκτρικής εστίασης ακολουθούμενης από ανοσοαποτύπωση (ΙΗΕ) (θεωρούμενη ως μέθοδος αναφοράς) και της εμπορικά διαθέσιμης ημιαυτοποιημένης μεθόδου της ηλεκτροφόρησης σε γέλη αγαρόζης υψηλής ηλεκτροφορητικής ευκρίνειας ακολουθούμενης από ανοσοκαθήλωση (ΗΥΗΕ), καθώς είναι ελάχιστα τα βιβλιογραφικά δεδομένα που συγκρίνουν τις συγκεκριμένες μεθόδους. Επιπλέον, υπολογίστηκε ο δείκτης IgG για όλα τα δείγματα και οι τιμές του συγκρίθηκαν με τα αποτελέσματα των ηλεκτροφορητικών μεθόδων. Υλικό της μελέτης αποτέλεσαν 225 δείγματα Ε.Ν.Υ και ορού ασθενών που νοσηλεύτηκαν στη Νευρολογική Κλινική του ΠΓΝΑ “Γ. ΓΕΝΝΗΜΑΤΑΣ” με την υποψία Σκλήρυνσης Κατά Πλάκας σε χρονικό διάστημα τριάντα έξι μηνών.Προκειμένου για τη μέθοδο της ισοηλεκτρικής εστίασης εφαρμόστηκε η μέθοδος όπως υποδεικνύεται από τους Keir και συνεργάτες. Για την ηλεκτροφόρηση σε γέλη αγαρόζης υψηλής ηλεκτροφορητικής ευκρίνειας χρησιμοποιήθηκε η εμπορικά διαθέσιμη μέθοδος HYDRAGEL 6 CSF (Sebia, Lisses, France), ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή, σε συσκευή της εταιρείας Sebia. Ο δείκτης IgG υπολογίστηκε με βάση τον λόγο (IgG ΕΝΥ/ IgG ορού) / (αλβουμίνη ΕΝΥ/ αλβουμίνη ορού), όπου φυσιολογικές θεωρήθηκαν τιμές <= 0,7.Η συμφωνία μεταξύ των μεθόδων IHE και ΗΥΗΕ ήταν 98.7% και ο δείκτης kappa ήταν 0.97 (p<0.001) δείχνοντας άριστη συμφωνία μεταξύ των μεθόδων. Από τα 91 δείγματα που βρέθηκαν θετικά με τη μέθοδο IHE, 88 βρέθηκαν θετικά και με τη μέθοδο ΗΥΗΕ. Δεν υπήρξε ούτε ένα δείγμα ασθενούς που να είναι θετικό με τη μέθοδο ΗΥΗΕ και αρνητικό με τη μέθοδο της ισοηλεκτρικής εστίασης. Αντιθέτως, υπήρξαν τρία δείγματα ασθενών, που καταγράφηκαν ως θετικά με τη μέθοδο της ισοηλεκτρικής εστίασης και αρνητικά με τη μέθοδο ΗΥΗΕ. Εξετάζοντας τη συμφωνία μεταξύ της ΗΥΗΕ και των τιμών του δείκτη ΙgG καταγράφουμε ότι η συμφωνία ήταν 84.0% και ο δείκτης kappa ήταν 0.65 (p<0.001), δείχνοντας καλή συμφωνία μεταξύ των μεθόδων. Από τους 72 ασθενείς οι οποίοι είχαν αυξημένο δείκτη IgG, οι 62 είχαν και θετικό αποτέλεσμα για παρουσία ολιγοκλωνικών ζωνών στο ΕΝΥ με τη μέθοδο ΗΥΗΕ. Ανάμεσα στους ασθενείς με φυσιολογικές τιμές δείκτη, υπήρχαν 28 οι οποίοι εμφάνιζαν ολιγοκλωνικές ζώνες στο ΕΝΥ τους. Εξάλλου, 9 από τους ασθενείς με αυξημένες τιμές δείκτη, είχαν αποτέλεσμα αρνητικό για ολιγοκλωνικές ζώνες. Το συμπέρασμα που προκύπτει είναι ότι όσον αφορά την εργαστηριακή αναζήτηση των ολιγοκλωνικών ζωνών στο ΕΝΥ η εμπορικά διαθέσιμη ημιαυτοποιημένη μέθοδος ΗΥΗΕ, μπορεί επαρκώς να αντικαταστήσει την περισσότερο απαιτητική μέθοδο της ισοηλεκτρικής εστίασης. Ως μειονέκτημα της ΗΥΗΕ μπορεί να θεωρηθεί ο μικρότερος αριθμός ζωνών σε σχέση με την ΙΗΕ, γεγονός που μπορεί να επηρεάσει ερμηνευτικά το αποτέλεσμα σε περισσότερο απαιτητικά δείγματα. Προκειμένου για τον δείκτη IgG εξάγεται το συμπέρασμα, ότι σε καμία περίπτωση δεν μπορεί να αντικαταστήσει τις ποιοτικές μεθόδους ανίχνευσης των ολιγοκλωνικών ζωνών, αλλά μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό με τα υπόλοιπα δεδομένα (κλινικά και εργαστηριακά), προκειμένου να υποβοηθηθεί η διαγνωστική σκέψη.