Ανοσοϊστοχημική μελέτη της σηματοδοτικής οδού TGFβ/Smad σε καλοήθεις οδοντογενείς όγκους των γνάθων

Abstract

INTRODUCTION: Odontogenic tumors encompass a heterogenous group of jaw lesions with distinct histopathological features that mimic the stages of normal odontogenesis and they are derived from the dental sperm or other odontogenic tissues. Ameloblastoma represents a true neoplasm, Calcified Cystic Odontogenic Tumor a benign cystic neoplasm and Adenomatoid Odontogenic Tumor a benign neoplasm or hamartoma according to some authors. Ameloblastoma and Adenomatoid Odontogenic Tumor are composed of odontogenic epithelium embedded in a mature connective tissue stroma while Calcifying Cystic Odontogenic Tumor originates from odontogenic epithelium with odontogenic ectomesenchyme, with or without hard tissue formation.The etiology of odontogenic tissues oncogenic transformation and the developing interactions between them during tumorigenesis have not yet been clarified. Nevertheless, studies on odontogenic tumors have shown several gene abnormalities and signaling pathway disfunctions involved in oncogenesis and odontogenesis.The TGF-β/Smad signaling pathway greatly contributes to the cellular homeostasis through control and multilevel regulation of numerous cellular functions, such as proliferation, differentiation, apoptosis, immigration and adhesion. Among others, TGF-β/Smad signaling pathway regulates the various stages of odontogeness and is involved in numerous pathological processes such as oncogenesis. In particular, human TGF-β has three isoforms (TGF-β1, -β2, and -β3) with TGF-β1 being the most common. After binding to a pair or transmembrane receptors TGF-β signals are transferred to cell nucleus through Smad transcriptional factors, causing stimulation or inhibition of target genes. TGF-β through paracrine and autocrine regulation of epithelial-mesenchymal interactions is involved in all stages of odontogenesis and homeostasis of odontogenic epithelium. Similarly, Smads are essential for tooth formation and growth and are expressed both by the dental epithelium and mesenchyme. Regarding oncogenesis, TGF-β demonstrates a dual role as it acts as an oncosuppressor factor at early stages while later promotes tumorigenesis. Several, alterations along the TGF-β/Smad signaling pathway have been described in several cancer types such as colon, endometrial and head and neck malignancies. More specifically, a decreased expression and/or mutation of TGF-β1, its receptors and Smad4 has been reported in oral squamous cell carcinoma, while loss of TGF-β1 expression is considered an early event during malignant transformation of oral epithelium.AIM: The aim of this study was to evaluate the immunoexpression of the TGF-β/Smad core signaling pathway members, TGF-β1, Smad1/5/8, Smad2/3 and Smad4 in ameloblastoma (AM), calcifying cystic odontogenic tumor (CCOT) and adenomatoid odontogenic tumor (AOT) in an attempt to contribute to the understanding of odontogenic tumors pathogenesis and the oncogenic transformation of the odontogenic epithelium.MATERIALS & METHODS: This retrospective cross-sectional study included 65 tissue specimens: 34 AMs, 13 CCOTs and 18 AOTs retrieved from the archives of the Department of Oral Pathology & Medicine of the Dental Faculty of the University of Athens and the Division of Oral Pathology, Dental School of the University of Minnesota, USA. Formalin–fixed serial sections were immunohistochemically stained with TGF-β1, Smad4, Smad1/5/8 and Smad2/3 antibodies either manually or automatically (BOND TM Max System, Leica).Subsequently, the tissue specimens were evaluated regarding the immunostaining (positivity, localization, grade) by two oral pathologists independently using a 0-3 scale (0: no immunoreactivity, 1:<20% positive cells, 2: 20-50% positive cells, 3: >50% positive cells). RESULTS: All biomarkers studied were found significantly decreased in AM compared to CCOT and AOT. AOT and CCOT exhibited higher expression of Smad1/5/8 compared to AM (OR=11.66, p<0.001 and OR=5.34, p=0.013 respectively) and Smad2/3 immunostaining was found significantly increased in CCOT (OR=7.56, p=0.003) and AOT (OR=4.06, p=0.014) compared to AM. Similarly, Smad4 expression was significantly increased in AOT and CCOT compared to AM (p=0.001), whereas AOT demonstrated a 5-fold higher possibility to express TGF-β1 compared to AM (p=0.011).CONCLUSIONS: The conclusions of the present study are the following:1)TGF-β/Smad signaling pathway is activated in AM, AOT and CCOT as indicated from the varying immunoexpression patterns of the odontogenic epithelium elements. Probably, TGF-β/Smad signaling pathway contributes to the regulation of neoplastic processes regarding odontogenic epithelium.2)The reduced TGF-β1 immunoexpression in AM compared to AOT/CCOT could be attributed to the aggressive biological behavior of AM, thus inducing increased cell proliferation, invasion and expanding capacity of the tumour.3)In total, the significantly reduced TGF-β1/Smad immunoexpression in AM compared to AOT/CCOT could be attributed to the increased cell proliferation and decreased differentiation and apoptosis rate observed in AM compared to AOT/CCOT.4)The lack of correlation between TGF-β1 and Smad2/3 immunoexpression underlines a possible disorder along the TGF-β1/Smad signaling pathway (either on the TGF-β1 or Smad level) that leads to neoplastic transformation of odontogenic epithelium and the development of odontogenic tumors through the reduced anti-proliferative effect mediated by TGF-β1.5)Smad4 seems to play an important role in the pathogenesis of odontogenic tumors as it showed the strongest immunoexpression between all molecules studied. That could possibly indicate the increased transcriptional activity generated during the growth of AM, AOO and COOT. 6)The significantly reduced Smad4 immunoexpression in AM compared to AOO/CCOT could be attributed to the reduced oncosuppressive signaling generated by TGF-β1 during AM tumorigenesis. Probably, Smad4 could serve as a supplementary diagnostic index in distinguishing odontogenic tumors of high and low neoplastic capacity.7)The increased Smad1/5/8/ immunoexpression in AOO and CCOT compared to AM could be attributed to an increased signaling generated by BMPs (Bone Morphogenetic Proteins) in tumors with calcified dental tissues. Thus, the present study demonstrated that TGF-β/Smad signaling pathway is activated in AM, AOT, and CCOT and comprises a major contributor to the pathogenesis of benign odontogenic tumors as its quantitative and/or qualitative disturbance at some level could lead to the neoplastic transformation of odontogenic epithelium. The statistically reduced TGF-β1/Smad immunoexpression in AM compared to AOT/CCOT could be attributed to the more agressive biological behavior of AM including increased cell proliferation and reduced apoptosis and differentiation. Specifically, Smad4 quantitative immunoexpression could serve as a supplementary diagnostic tool for the distinction between odontogenic tumors of high and low neoplastic capacity.

ΕΙΣΑΓΩΓΗ: Οι οδοντογενείς όγκοι αποτελούν μία ετερογενή ομάδα βλαβών των γνάθων με ιδιαίτερα ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά που μιμούνται τα στάδια της φυσιολογικής οδοντογένεσης και προέρχονται από το οδοντικό σπέρμα ή άλλους οδοντογενείς ιστούς. Το Αδαμαντινοβλάστωμα αναπαριστά αληθές νεόπλασμα, ο Ενασβεστιούμενος Κυστικός Οδοντογενής Όγκος καλόηθες κυστικό νεόπλασμα και ο Αδενωματοειδής Οδοντογενής Όγκος καλόηθες νεόπλασμα ή αμάρτωμα κατά ορισμένους συγγραφείς.Τα αίτια της πρόσκτησης ογκογόνου δυναμικού από τους οδοντογενείς ιστούς και οι μεταξύ τους επαγωγικές αλληλεπιδράσεις που συντελούν στο σχηματισμό των διάφορων τύπων όγκων δεν έχουν αποσαφηνιστεί. Σε μελέτες οδοντογενών όγκων διαπιστώνονται διαταραχές σε γονίδια και σε σηματοδοτικά μονοπάτια που εμπλέκονται στην ογκογένεση και την οδοντογένεση. Η σηματοδοτική οδός TGF-β/Smad συμβάλλει καθοριστικά στην κυτταρική ομοιόσταση μέσω ελέγχου και πολυεπίπεδης ρύθμισης μεγάλου αριθμού ποικίλων κυτταρικών λειτουργιών όπως ο πολλαπλασιασμός, η διαφοροποίηση, η απόπτωση, η μετανάστευση και η συγκόλληση. Μεταξύ άλλων, η TGF-β/Smad σηματοδοτική οδός μετέχει στον έλεγχο των διαφόρων σταδίων της οδοντογένεσης και εμπλέκεται στην αιτιοπαθογένεια ποικίλων παθολογικών διεργασιών όπως η ογκογένεση.ΣΚΟΠΟΣ: Σκοπός της παρούσης μελέτης είναι η αξιολόγηση της ανοσοϊστοχημικής έκφρασης των σηματοδοτικών μορίων TGF-β1, Smad1/5/8, Smad2/3 και Smad4, που κατέχουν κομβικές θέσεις κατά μήκος της οδού TGF-β/Smad, στο Αδαμαντινο¬βλάστωμα (ΑΜ), τον Αδενωματοειδή Οδοντογενή Όγκο (ΑΟΟ) και τον Ενασβεστιούμενο Κυστικό Οδοντογενή Όγκο (ΕΚΟΟ). Τα αποτελέσματα της μελέτης θα συμβάλουν στην κατανόηση της παθογένειας των οδοντογενών όγκων και ιδιαίτερα της ογκογόνου εξαλλαγής του οδοντογενούς επιθηλίου. ΥΛΙΚΟ & ΜΕΘΟΔΟΣ: Το υλικό της αναδρομικής αυτής μελέτης αποτέλεσαν 65 περιπτώσεις καλόηθων οδοντογενών όγκων των γνάθων: 34 περιπτώσεις αδαμαντινο¬βλαστώματος (ΑΜ), 13 περιπτώσεις ενασβεστιούμενου κυστικού οδοντογενούς όγκου (ΕΚΟΟ) και 18 περιπτώσεις αδενωματοειδούς οδοντογενούς όγκου (ΑΟΟ) που προέρχονται από τα αρχεία του εργαστηρίου Στοματολογίας της Οδοντιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Αθηνών και από το Division of Oral Pathology της Οδοντιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου της Minnesota. Στη συνέχεια οι τομές των ιστοτεμαχίων που είχαν μονιμοποιηθεί σε φορμόλη χρώσθηκαν ανοσοϊστοχημικά σε αυτόματο μηχάνημα (BOND TM Max System, Leica) και δια χειρός με αντισώματα έναντι των δεικτών Smad1/5/8, Smad2/3, Smad4 και TGF-β1.Κατόπιν, τα δείγματα εξετάστηκαν αναφορικά με την ανοσοϊστοχημική χρώση (θετικότητα, εντόπιση, βαθμός) από 2 μελετητές ανεξάρτητα Σε όλες τις περιπτώσεις η ανοσοϊστοχημική χρώση εκφράστηκε βάσει του ποσοστού των θετικών στοιχείων σε κλίμακα από το 0 μέχρι το 3. Τα αρνητικά δείγματα εντάχθηκαν στην κατηγορία 0, εκείνα που είχαν ποσοστό ανοσοχρωσμένων κυττάρων κάτω από το 20% στην κατηγορία 1, εκείνα που εμφάνισαν 20-50% θετικών κυττάρων στην κατηγορία 2 και τέλος εκείνα που είχαν >50% θετικά κύτταρα συμπεριλήφθηκαν στην κατηγορία 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: : Όλοι οι μοριακοί δείκτες που μελετήθηκαν βρέθηκαν σημαντικά μειωμένοι στο ΑΜ συγκριτικά με τον ΑΟΟ και τον ΕΚΟΟ. Συγκε¬κριμένα, ο ΑΟΟ και ΕΚΟΟ παρουσίασαν υψηλότερη έκφραση του Smad1/5/8 συγκριτικά με το ΑΜ (OR=11.66, p<0.001 και OR=5.34, p=0.013 αντίστοιχα) και η ανοσοέκφραση του Smad2/3 βρέθηκε πιο αυξημένη στον ΕΚΟΟ (OR=7.56, p=0.003) και στον AOΟ (OR=4.06, p=0.014) σε σύγκριση με το AM σε βαθμό στατιστικά σημαντικό. Ομοίως, η ανοσοέκφραση του Smad4 βρέθηκε σημαντικά πιο υψηλή στον AOΟ και στον ΕΚΟΟ σε σχέση με το AM (p=0.001). Επιπλέον, ο ΑΟΟ εμφάνισε κατά 5 φορές μεγαλύτερη πιθανότητα να εκφράσει τον TGF-β1 συγκριτικά με το ΑΜ (p=0.011).ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Τα συμπεράσματα που προκύπτουν από τη μελέτη είναι τα ακόλουθα:1)Η σηματοδοτική οδός TGF-β/Smad είναι ενεργοποιημένη στο ΑΜ, ΑΟΟ και στον ΕΚΟΟ όπως υποδεικνύεται από την ποικίλου βαθμού ανοσοέκφραση που παρατηρήθηκε στα στοιχεία του οδοντογενούς επιθηλίου των οδοντογενών όγκων που εξετάστηκαν. Πιθανά, η σηματοδοτική οδός TGF-β/ Smad μετέχει στη ρύθμιση των νεοπλασματικών διεργασιών του οδοντογενούς επιθηλίου.2)Η σημαντικά μειωμένη ανοσοέκφραση του TGF-β1 στο ΑΜ συγκριτικά με τον ΑΟΟ και τον ΕΚΟΟ θα μπορούσε να αποδοθεί στην πιο επιθετική βιολογική συμπεριφορά που εμφανίζει το ΑΜ ως αληθές νεόπλασμα, προάγοντας τον αυξημένο κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη διηθητικότητα και την επεκτατικότητα του όγκου. 3)Συνολικά, η μειωμένη ανοσοέκφραση του TGF-β1 και των Smad που παρατηρήθηκε στο ΑΜ συγκριτικά με τον ΑΟΟ και τον ΕΚΟΟ θα μπορούσε να αποδοθεί στο διαφορετικό βαθμό κυτταρικού πολλαπλασιαμού, διαφοροποίησης και απόπτωσης που χαρακτηρίζει τα ΑΜ.4)Η απουσία συσχέτισης μεταξύ της ανοσοέκφρασης του TGF-β1 και του Smad2/3 υποδηλώνει την ύπαρξη κάποιας διαταραχής κατά μήκος της σηματοδοτικής οδού TGF-β/Smad (είτε στο επίπεδο του TGF-β1 είτε των Smad) που μπορεί να καταλήγει στη νεοπλασματική εξαλλαγή του οδοντογενούς επιθηλίου και στην ανάπτυξη των οδοντογενών όγκων μέσω της περιορισμένης αντι-πολλαπλασιαστικής δράσης του TGF-β1.5) Ιδίως, το Smad4 φαίνεται να διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην παθογένεια των οδοντογενών όγκων όπως προκύπτει από την υψηλότερη ανοσοέκφραση που παρουσίασε μεταξύ των δεικτών που μελετήθηκαν, γεγονός που πιθανά υποδηλώνει την αυξημένη μεταγραφική δραστηριότητα που εκλύεται κατά την ανάπτυξη των ΑΜ, ΑΟΟ και ΕΚΟΟ. 6)Η μειωμένη έκφραση του Smad4 στο ΑΜ συγκριτικά με τον ΑΟΟ και ΕΚΟΟ θα μπορούσε να οφείλεται στη μειωμένη ογκοκατασταλτική σηματοδότηση που εκλύεται από τον TGF-β1 κατά την ανάπτυξη του ΑΜ. Πιθανά, το Smad4 θα μπορούσε να αξιοποιηθεί ως συμπληρωματικός διαγνωστικός δείκτης διάκρισης μεταξύ οδοντογενών όγκων με υψηλό και χαμηλό νεοπλασματικό δυναμικό.7)Η υψηλότερη ανοσοέκφραση του Smad1/5/8 σε ΑΟΟ και ΕΚΟΟ συγκριτικά με τα ΑΜ θα μπορούσε να αποδοθεί στην αυξημένη σηματοδότηση που επάγεται από τις ΒΜΡ σε όγκους που εμπεριέχουν ενασβεστιωμένους οδοντι¬κούς ιστούς. Επομένως, η παρούσα μελέτη έδειξε ότι σηματοδοτική οδός TGF-β/Smad συμβάλλει καθοριστικά στην παθογένεια των καλόηθων οδοντογενών όγκων, καθώς η ποιοτική και/ή ποσοτική διαταραγμένη σηματοδότησή της σε κάποιο επίπεδο μπορεί να οδηγήσει σε νεοπλασματική εξαλλαγή του οδοντογενούς επιθηλίου. Ειδικότερα, η ποσοτική ανοσοέκφραση του Smad4 θα μπορούσε να αποτελέσει συμπληρωματικό διαγνωστικό δείκτη για το διαχωρισμό οδοντογενών όγκων με υψηλό και χαμηλό νεοπλασματικό δυναμικό.