Σύνθεση, κινητική και κρυσταλλογραφική µελέτη δυνάµει αναστολέων της φωσφορυλάσης του γλυκογόνου

Abstract

Diabetes mellitus is a chronic metabolic non-communicable disease that results from abnormal glucose metabolism. The subsequent increase of glycaemia induces a number of health complications. Diabetes mellitus is one of the earliest diseases known to humans, yet, in our days it is considered as a pandemia, with severe global, economic and social consequences. Although there is no complete therapy, the disease can be controlled initially through changes in the patient’s lifestyle and afterwards through administration of antidiabetic drugs such as biguanides (metformin), sulfonylureas and insulin at increasing dosages, with the aim of controlling blood glucose levels. Unfortunately, accomplishment of the therapeutic targets usually fails and current drugs are responsible for serious side-effects. Therefore, there is a need for discovery of new drugs with improved pharmacological properties against diabetes mellitus. Since liver is the organ mainly responsible for glucose metabolism, various hepatic proteins have been used as macromolecular targets for the development of new therapies, in particular glucagon receptor (GR), glucose-6-phosphate phosphatase (G6PASE), fructose-1,6-diphosphate phosphatase (F16BPASE), hexokinase IV (GK) and glycogen phosphorylase (GP), the last being the topic of the current thesis. GP is a key enzyme for glycogen breakdown in liver and its active form (GPa) catalyzes the first step of phosphorolysis of glycogen to glucose. According to previous studies conducted by us and others, GP is a validated molecular target for the design and development of new potential inhibitors of glycogenolysis, with the ultimate goal to regulate blood glucose levels. Various compounds have been designed through the structure-basedintelligent-drug-design approach, as inhibitors of GP. In our laboratory, 4-substituted-βD-glucopyranosyl-pyrimidines have been developed which bind strongly at the catalytic site of the enzyme. The goal of this thesis was (a) the development of an optimized and versatile synthetic scheme that allows easy access to N4-aryl- and alkyl- substituted β-D-glucopyranosylcytosines; (b) the application of the new synthetic scheme in the development of a synthetically broad set of arylamines and alkylamines which include new characteristic groups at position 4- of the above lead compounds; (c) the kinetic study of the inhibition exerted by the above compounds at the in vitro activity of GP; (d) the crystallographic study of enzyme:inhibitor complexes with the aim of deciphering the interactions between them, mainly inside the β-channel of the catalytic site, and which can explain the observed inhibition and (e) the extraction of a map of positive interactions. From the perspective of chemical synthesis, various methods of activation of β-Dglucopyranosyl-uracil at position 4- were studied and found that the combination of Ν1(2,3,4,6-tetra-Ο-acetyl)-β-D-glucopyranosyl--(1,2,4-triazol-yl)pyrimidin-2-one with microwave irradiation led to a facile, versatile and high yielding total synthetic route. In this manner, 17 new potential inhibitors of GP were synthesized (p. 7, compounds 60b and 63b were already synthesized and utilized in this thesis as leads), and subsequently studied through enzyme kinetics towards their inhibitor potency. By determining their IC50 values as well as the Ki values for the most potent of them, a number of low nM inhibitors have been discovered and, most importantly, the second most potent up-to-date inhibitor for the catalytic site of GP, Ν1-β-D-glucopyranosyl-Ν4[4-acridin-9(10Η)-oxo]cytosine (90b, p. 7) with Ki = 71 nM. The binding mode of the new inhibitors as complexes with GP was studied with X-ray crystallography. Detailed mapping of the inhibitor interactions with the catalytic site of the enzyme and the knowledge derived from it, helped explain the kinetic results and correlate them with the inhibitor structure. The interaction map was exploited in the design and synthesis of compounds with improved characteristics. Finally, the best inhibitors were tested in a series of preliminary biological experiments for the evaluation of their ability to regulate glycaemia in vivo.

Ο σακχαρώδης διαβήτης αποτελεί ένα χρόνιο, µεταβολικό, µη-µεταδιδόµενο νόσηµα που οφείλεται στον µη φυσιολογικό µεταβολισµό της γλυκόζης από τον οργανισµό και την αυξηµένη συγκέντρωσή της στο αίµα, µε αποτέλεσµα να προκαλεί µια σειρά διαταραχών. Πρόκειται για µια από τις αρχαιότερες ασθένειες η οποία, στις µέρες µας έχει λάβει τον χαρακτήρα παγκόσµιας επιδηµίας µε σηµαντικότατες οικονοµικές και κοινωνικές επιπτώσεις. Αν και δεν θεραπεύεται ριζικά, αντιµετωπίζεται αρχικά µε αλλαγή στον τρόπο ζωής και στη συνέχεια µε χορήγηση αντιδιαβητικών φαρµάκων όπως διγουανίδες (µετφορµίνη), σουλφονυλουρίες και ινσουλίνη µε συνεχή αύξηση των δόσεων, µε σκοπό την κατά το δυνατόν διατήρηση φυσιολογικών επιπέδων γλυκαιµίας. ∆υστυχώς οι θεραπευτικοί στόχοι συνήθως αποτυγχάνουν και τα υπάρχοντα φάρµακα εµφανίζουν σοβαρές παρενέργειες. Συνεπώς, υπάρχει διαρκής ανάγκη για ανακάλυψη νέων ουσιών µε βελτιωµένα φαρµακολογικά αποτελέσµατα έναντι του σακχαρώδους διαβήτη. Το ήπαρ είναι υπεύθυνο κυρίως για το µεταβολισµό της γλυκόζης και για το λόγο αυτό αρκετές πρωτεΐνες του έχουν αποτελέσει αντικείµενο έρευνας για την ανάπτυξη θεραπειών. Μοριακοί στόχοι αποτελούν ο υποδοχέας γλυκαγόνης (Glucagon Receptor, GR), η φωσφατάση της 6-φωσφορικής γλυκόζης (G6PASE), η φωσφατάση της 1,6-διφωσφορικής φρουκτόζης (F16BPASE), η εξοκινάση IV (GK) και η φωσφορυλάση του γλυκογόνου (GP).Η τελευταία, στην ενεργή της µορφή (GPa) καταλύει το πρώτο στάδιο της αποικοδόµησης του γλυκογόνου προς γλυκόζη. Η GP είναι ένα από τα ένζυµα που εµπλέκονται άµεσα στην αποικοδόµηση του γλυκογόνου στο ήπαρ. Προηγούµενες µελέτες, στο δικό µας και άλλα εργαστήρια, έδειξαν ότι αποτελεί µοριακό στόχο για το σχεδιασµό και την ανάπτυξη νέων δυνάµει αναστολέων έναντι της γλυκογενόλυσης, µε σκοπό τη διατήρηση των φυσιολογικών επιπέδων γλυκόζης στην κυκλοφορία του αίµατος. Πολλές ενώσεις έχουν σχεδιαστεί µε τη µέθοδο του κατευθυνόµενου από τη δοµή σχεδιασµού φαρµάκων, ως αναστολείς της GP. Στο εργαστήριο µας έχουν αναπτυχθεί 4-υποκατεστηµένες β-D-γλυκοπυρανοζυλοπυριµιδίνες οι οποίες προσδένονται ισχυρά στο καταλυτικό κέντρο του ενζύµου. Το αντικείµενο της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν (α) η ανάπτυξη ενός βελτιστοποιηµένου και γενικού συνθετικού σχήµατος για την εύκολη πρόσβαση σε Ν4αρυλο και αλκυλο υποκατεστηµένες β-D-γλυκοπυρανοζυλο-κυτοσίνες, (β) η εφαρµογή του νέου συνθετικού σχήµατος για την εισαγωγή µιας ευρείας οµάδας αρυλαµινών και αλκυλαµινών, που περιέχουν νέες χαρακτηριστικές οµάδες στην 4-θέση των παραπάνω ενώσεων οδηγών, (γ) η κινητική µελέτη της αναστολής που επιφέρουν τα παραπάνω συνθετικά µόρια στην in vitro δραστικότητα της GP, (δ) η κρυσταλλογραφική µελέτη συµπλόκων ενζύµου αναστολέα για τον προσδιορισµό των αλληλεπιδράσεων που αναπτύσσονται κυρίως στο β-υποκέντρο του καταλυτικού κέντρου και µπορούν να εξηγήσουν την παρατηρούµενη αναστολή και τέλος, (ε) η εξαγωγή ενός χάρτη θετικών αλληλεπιδράσεων που θα µπορούσε να χρησιµοποιηθεί στο σχεδιασµό νέων αναστολέων. Συνθετικά, µελετήθηκαν διάφορες µέθοδοι ενεργοποίησης της β-D-γλυκοπυρανοζυλοουρακίλης στην 4- θέση και βρέθηκε ότι ο συνδυασµός Ν1-(2,3,4,6-τετρα-Ο-ακετυλο)-βD-γλυκοπυρανοζυλο--(1,2,4-τριαζολυλο)πυριµιδιν-2-όνης µε µικροκυµατική ακτινοβολία οδήγησε σε µια εύκολη, ευέλικτη και υψηλής απόδοσης συνολική συνθετική πορεία: Με τον τρόπο αυτό συντέθηκαν 17 νέοι, δυνάµει αναστολείς της GP (σελ 7, οι ενώσεις 60b και 63b είχαν συντεθεί ήδη και χρησίµευσαν ως ενώσεις-οδηγοί), οι οποίοι µελετήθηκαν µε ενζυµική κινητική ως προς την ανασταλτική τους ισχύ. Ο προσδιορισµός των τιµών IC50 όλων των νέων αναστολέων και της σταθεράς Ki των ισχυρότερων από αυτούς, ανέδειξε αρκετούς αναστολείς µε τιµή σταθεράς αναστολής στην χαµηλή περιοχή των nM και, κυρίως, τον δεύτερο ισχυρότερο µέχρι σήµερα αναστολέα του καταλυτικού κέντρου, που αποτελεί η ένωσηΝ1-β-D-γλυκοπυρανοζυλοΝ4-[4-ακριδινο-9(10Η)-οξο]κυτοσίνη (90b, σελ. 9) µε τιµή Ki = 71 nM. Ο τρόπος σύνδεσης των νέων αναστολέων ως σύµπλοκα µε την GP διερευνήθηκε µε χρήση κρυσταλλογραφίας ακτίνων-Χ. Η λεπτοµερής χαρτογράφηση των αλληλεπιδράσεων που σχηµατίζουν οι ενώσεις κατά τη σύνδεσή τους στο καταλυτικό κέντρο του ενζύµου και η γνώση που προέκυψε εξήγησε τα κινητικά συµπεράσµατα και τη συσχέτισή τους µε τη δοµή ενός αναστολέα, ενώ αξιοποιήθηκε στο σχεδιασµό και τη σύνθεση ενώσεων µε βελτιωµένα χαρακτηριστικά.