Μελέτη των δράσεων της βιταμίνης D₃ σε φυσιολογικά και παθολογικά κύτταρα

Abstract

Vitamin D₃ and its analog paricalcitol, are beneficial in human and experimental chronic kidney disease (CKD), the leading cause of which is diabetic nephropathy (DN). Apart from their general efficacy to the treatment of secondary hyperparathyroidism in haemodialysis patients these two molecules also improve the inflammatory status and proteinuria in these patients. In one approach to study the beneficial role of paricalcitol we studied its effects on PAF biosynthesis as well as other inflammatory mediators implicated in CKD. In a separate approach, we used immortalized human podocytes (HGEC) to assess the expression profile of the podocytic-associated proteins podocalyxin and nephrin after treatment with 1,25-dihydroxyvitamin D₃ (calcitriol) and its analogue paricalcitol. In vitro paricalcitol inhibited PAF/thrombin-induced platelet aggregation and the inhibitory effect was comparable with that of PAF/thrombin antagonists. In addition, paricalcitol inhibited in vitro the PAF-CPT activity in platelets and leukocytes and increased PAF-AH activity in leukocytes. However, much higher concentrations of paricalcitol were needed to inhibit λύσο-PAF-AT activity. Similarly, in haemodialysis patients, paricalcitol treatment reduced PAF-CPT activity in platelets and leukocytes and increased PAF-AH activity in leukocytes, while λύσο-PAF-AT activity remained unaltered. On the other hand paricalcitol therapy reduced the expression levels of IL-8, IL-1b, and TNF-a and increased VEGF levels. These results further support the beneficial effects of vitamin D treatment in haemodialysis patients, since it strongly affects PAF/thrombin activities, PAF-metabolism and IL-8, IL-1b, TNF-a and VEGF circulating levels. HGEC exhibit high-glucose-mediated downregulation of podocalyxin and nephrin, loss of which has been linked with loss of the permselective renal barrier and proteinuria. Calcitriol and paricalcitol reversed high glucose-induced decrease of nephrin and significantly enhanced podocalyxin expression in podocytes cultured in high glucose. HGEC express VDR and retinoid X receptor (RXR). In the presence of calcitriol and paricalcitol VDR expression was up-regulated and VDR co-localized with RXR in the nucleus. VDR knock-down abolished the protective action of calcitriol and paricalcitol on podocalyxin expression indicating that podocalyxin activation of expression is partly mediated by VDR. Furthermore VDR specifically regulates podocalyxin expression by bounding to a site upstream of the podocalyxin promoter. Vitamin D analogues maintain and furthermore, re-activate the expression of specialized components of podocytes including podocalyxin, hence they provide protection against loss of the permselective renal barrier, with molecular mechanisms elucidated herein.

Η βιταμίνη D₃ και το ανάλογο της παρικαλσιτόλη έχουν ευεργετικές δράσεις στην χρόνια νεφρική νόσο (ΧΝΝ), μια από τις κυριότερες αιτίες της οποίας είναι η διαβητική νεφροπάθεια (ΔΝ). Εκτός από τη ευρεία αποδεχτή αποτελεσματικότητα της βιταμίνης D και των αναλόγων της στη θεραπεία του δευτεροπαθούς υπερπαραθυρεοειδισμού γνωρίζουμε επίσης ότι σε ασθενείς που υποβάλλονται σε αιμοκάθαρση η χορήγηση της βελτιώνει τη φλεγμονώδη κατατομή και την πρωτεϊνουρία. Μελετήσαμε την επίδραση της παρικαλσιτόλης στο μεταβολισμό του PAF (Platelet Activating Factor) και στα επίπεδα άλλων φλεγμονωδών παραγόντων που εμπλέκονται στη ΧΝΝ. Επίσης, χρησιμοποιήσαμε αθανατοποιημένα ανθρώπινα ποδοκύτταρα (HGEC) για την αξιολόγηση της δράσεως της βιταμίνης D (καλσιτριόλη) και της παρικαλσιτόλης στην έκφραση των ποδοκυτταρικών πρωτεϊνών όπως η ποδοκαλυκίνη και η νεφρίνη. Η παρικαλσιτόλη ανέστειλε in vitro την προκαλούμενη από τον PAF ή την θρομβίνη συσσώρευση των αιμοπεταλίων. Επιπλέον, η παρικαλσιτόλη ανέστειλε in vitro το βιοσυνθετικό ένζυμο της de novo πορείας βιοσύνθεσης-PAF-CPT των αιμοπεταλίων και των λευκοκυττάρων και αύξησε το αποικοδομητικό ένζυμο PAF-AH των λευκοκυττάρων, ενώ πολύ υψηλότερες συγκεντρώσεις παρικαλσιτόλης ήταν αναγκαίες για να μειωθεί η δραστικότητα του βιοσυνθετικού ενζύμου της πορείας του ανασχηματισμού, λύσο-PAF-AT. Ομοίως, in vivo, σε ασθενείς που υποβάλλονται σε αιμοκάθαρση, η χορήγηση παρικαλσιτόλη για ένα μήνα μείωσε την PAF-CPT των αιμοπεταλίων και των λευκοκυττάρων και αύξησε την PAF-AH των λευκοκυττάρων, ενώ δεν επηρέασε την λύσο-PAF-AT. Επιπλέον η παρικαλσιτόλη μείωσε την συγκέντρωση των κυτταροκινών IL-8, IL-1β και TNF-α και αύξησε τον VEGF. Τα παραπάνω αποτελέσματα επεκτείνουν τις γνώσεις μας όσον αφορά τις ευεργετικές επιδράσεις της παρικαλσιτόλης σε ασθενείς που υποβάλλονται σε αιμοκάθαρση, αναδεικνύοντας νέα δεδομένα για τις δράσεις της παρικαλσιτόλης ως προς δράσεις του PAF και της θρομβίνης, τον μεταβολισμό του PAF και άλλες κυτταροκίνες όπως η IL-8, η IL-1β, ο TNF-α και ο VEGF. Τα ποδοκύτταρα που εκτίθενται σε υψηλή συγκέντρωση γλυκόζης παρουσιάζουν μειωμένη έκφραση ποδοκαλυκίνης και νεφρίνης. Η μείωση αυτή έχει συνδεθεί με την καταστροφή των ποδοειδών προεκβολών και συσχετίζεται με απώλεια της εκλεκτικής διήθησης στους νεφρούς και πρωτεϊνουρία. Παρουσία υψηλών συγκεντρώσεων γλυκόζης, η καλσιτριόλη και η παρικαλσιτόλη επαναφέρουν τα μειωμένα επίπεδα της νεφρίνης και ενισχύουν σημαντικά την έκφραση της ποδοκαλυκίνης στα HGEC. Τα ποδοκύτταρα εκφράζουν τον υποδοχέα της βιταμίνης D (VDR) και τον υποδοχέα του ρετινοϊκού οξέος Χ (RXR). Η παρουσία καλσιτριόλης και παρικαλσιτόλης προκαλεί την μετακίνηση του VDR στον πυρήνα και τον συνεντοπισμό του με τον RXR. Η σημασία του VDR στην ρύθμιση των επιπέδων της ποδοκαλυκίνης μελετήθηκε μέσω αποσιώπησης του γονιδίου του VDR με τη χρήση siRNA. Η αποσιώπηση του γονιδίου του VDR μείωσε την επαγόμενη από την καλσιτριόλη και παρικαλσιτόλη αύξηση των επιπέδων έκφρασης της ποδοκαλυκίνης φανερώνοντας ότι η ενεργοποίηση της έκφρασης της εν μέρει οφείλεται στην διαμεσολάβηση του VDR. Ενώ μέσω πειραμάτων ανοσοκατακρήμνισης DNA δείξαμε ότι ο VDR προσκολλάται σε ρυθμιστικές περιοχές του γονιδίου της ποδοκαλυκίνης επηρεάζοντας την έκφραση της. Συνεπώς, η χρήση της καλσιτριόλης και της παρικαλσιτόλης ενεργοποιεί την έκφραση ειδικών σημαντικών ποδοκυττάρικων πρωτεϊνών και δρα προστατευτικά κατά της απώλειας της εκλεκτικής διήθησης στους νεφρούς στη ΧΝΝ.