Έκφραση μέσω υψηλής εξόδου (HTP), χαρακτηρισμός και μελέτη αλληλεπίδρασης διαφόρων πρωτεϊνών EF -χειρός συνδεομένων με ασβέστιο (μέλη οικογε...

Abstract

Calcium is known to play an important role in many biological processes. Beyond its structural role in biology it may be argued that it plays a significant role in solution, as well. A large variety of calcium-binding proteins, interact with calcium ions mediating important cell processes. For example, calcium may initiate the binding of several proteins to biological membranes or even act as an in-cell messenger. S100 protein family, one of the largest categories of calcium-binding proteins, consists of 20 protein members. S100 is a multigenic family of non-ubiquitous Ca2+-modulated proteins implicated in intracellular and extracellular regulatory activities, such as the conduction and transmission of the nerve impulse, muscle contraction, cell motility, cell growth and differentiation, gene expression and secretion. In addition, it has been reported that several human diseases, such as heart disease, neurodegenerative diseases, inflammatory disorders and cancer are closely connected to S100 proteins. In view of the importance of S100 in the cell physiology and moreover in eukaryotes, we selected to study two protein member of the family, S100A5 and S100A7. Initially, human S100A5 was cloned and expressed by bacterial cells (E.coli). Following the isolation and purification of the protein, CD and multidimensional NMR experiments were performed. CD studies of the apo and Ca2S100A5, revealed that the protein conserves its secondary structure, whereas thermal stability experiments were performed for both forms of S100A5 (apo and Ca-loaded). On the other hand, the homodimeric solution structures of S100A5 in both the apo and the calcium(II) loaded forms have been obtained, by means of NMR spectroscopy. S100A5 is a calcium binding protein of the S100 family, with one canonical and one pseudo EF-hand motif per monomer. It can bind four calcium ions, while it seems to bind one zinc ion per monomer. The structural differences resulting upon calcium binding change the global shape and the distribution of hydrophobic and charged residues of the S100A5 homodimer. This rearrangement involves, in particular, the hinge loop connecting the N-terminal and the C-terminal EF-hand domains, a reorientation of helix III with respect to helix IV, as common to several S100 proteins, and a longer alpha helical structure of helix IV. Relaxation data show a quite large mobility in the hinge loop which is not quenched in the calcium form. All these structural changes may be important for protein function. Furthermore, human S100A7 was cloned and expressed by bacterial cells (E.coli). Following the extraction from the cells and final purification of the protein, interaction studies, by means of NMR spectroscopy, with its possible biological cofactors, EFABP and S100A10, were performed. Interestingly, apoS100A7 interacts with EFABP, in solution, but several difficulties on spectra recording made difficult the complete identification of protein-protein interactions resulting in the solution structure of the complex S100A7/EFABP. On the other hand, apoS100A7 clearly shows distinct interactions with apoS100A10, a possible target protein revealed recently. This may implicate the dissociation of S100A7 homodimer and formation of the S100A7/S100A10 heterodimer. We generally believe, any available information, including all the above, concerning the structure, the individual functions and interaction with other target proteins, for these S100 members can comprise great tools in clinical diagnosis and/or treatment of S100 related diseases.

Ο ρόλος του ασβεστίου σε πολλές από τις βιολογικές διεργασίες δεν θα μπορούσε παρά να χαρακτηριστεί εξαιρετικά σημαντικός. Πέραν των στερεών αποθέσεων του ασβεστίου εξίσου σημαντικός είναι ο ρόλος των ιόντων ασβεστίου (Ca2+) σε διάλυμα. Μεγάλος αριθμός ασβεστιοδεσμευτικών πρωτεϊνών αλληλεπιδρούν με ιόντα ασβεστίου μεσολαβώντας έτσι σε ένα ευρύ φάσμα φυσιολογικών λειτουργιών. Για παράδειγμα, το ασβέστιο αποτελεί τον εκκινητή της δέσμευσης αρκετών πρωτεϊνών σε βιολογικές μεμβράνες ή παίζει τον ρόλο του ενδοκυτταρικού αγγελιαφόρου. Μια σημαντική κατηγορία ασβεστιοδεσμευτικών πρωτεϊνών αποτελεί η οικογένεια των S100 πρωτεϊνών, η οποία, στον άνθρωπο αριθμεί περί τα 20 μέλη. Οι S100 είναι πολυλειτουργικές σηματοδοτικές πρωτεΐνες, ενώ εμπλέκονται στη ρύθμιση διάφορων κυτταρικών λειτουργιών όπως η συστολή, η κινητικότητα, η ανάπτυξη, η διαφοροποίηση, η μεταγραφή και η έκκριση. Επιπλέον, έχει βρεθεί ότι διάφορες ασθένειες (παθήσεις της καρδιάς, ασθένειες του κεντρικού νευρικού συστήματος, φλεγμονώδεις διαταραχές και καρκίνος), είναι στενά συνδεδεμένες με τις S100 πρωτεΐνες. Έχοντας υπόψη τη σημαντικότητα των S100 πρωτεϊνών στη φυσιολογία των κυττάρων και κατ‟ επέκταση στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς, στην παρούσα διατριβή επιλέχτηκαν, προς μελέτη, οι πρωτεΐνες S100A5 και S100A7. Αρχικά, κλωνοποιήθηκε και εκφράστηκε η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη S100A5 από βακτηριακά κύτταρα (E.coli). Ύστερα από την απομόνωση και τον καθαρισμό της πρωτεΐνης ακολούθησαν μελέτες μέσω φασματοσκοπίας κυκλικού διχρωισμού (CD) και πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR). Με τη χρήση της φασματοσκοπίας CD, ήταν δυνατό να εξαρθούν σημαντικά συμπεράσματα τόσο για την δευτεροταγή δομή της πρωτεΐνης όσο και για τη θερμική σταθερότητα του μορίου, απουσία και παρουσία ιόντων Ca2+. Αντίστοιχα, με τη βοήθεια της φασματοσκοπίας NMR, προσδιορίστηκαν οι τρισδιάστατες δομές, σε διάλυμα, της ελεύθερης (apoS100A5) και της συμπλεγμένης με ιόντα ασβεστίου πρωτεΐνης (Ca2S100A5). Η S100A5 δημιουργεί ομοδιμερή στα διαλύματα της, ενώ διαθέτει μια «κανονική» και μια «ψεύδο» EF-χείρα, ανά μονομερές. Βρέθηκε ότι το ομοδιμερές της πρωτεΐνης δεσμεύει 4 κατιόντα ασβεστίου, ενώ δύναται να δεσμεύει και ένα ιόν Zn2+, ανά μονομερές. Η δέσμευση των κατιόντων ασβεστίου στο ομοδιμερές της S100A5, επιφέρει σημαντικές αλλαγές στο σχήμα αλλά και ανακατανομή των υδροφοβικών και πολικών αμινοξικών καταλοίπων του ομοδιμερούς. Πιο συγκεκριμένα, οι αλλαγές αυτές περιλαμβάνουν το βρόχο που συνδέει την Ν-τελική και C-τελική EF-χείρα, την επαναδιευθέτηση της έλικας ΙΙΙ ως προς την έλικα IV καθώς και την αύξηση του χαρακτήρα α-έλικας της έλικας IV. Πειράματα αποκατάστασης καταδεικνύουν την ευκινησία του συνδετικού βρόχου τόσο στην apoS100a5 όσο και στην Ca2S100A5. Όλες αυτές οι δομικές αλλαγές πιθανόν να είναι σημαντικές για τη φυσιολογική λειτουργία της πρωτεΐνης. Επιπρόσθετα, κλωνοποιήθηκε και εκφράστηκε η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη πρωτεΐνη S100A7, από βακτηριακά κύτταρα (E.coli). Ύστερα από την απομόνωση και τον καθαρισμό της πρωτεΐνης ακολούθησαν μελέτες αλληλεπιδράσεων, μέσω φασματοσκοπίας πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR), με τους πιθανούς πρωτεϊνικούς στόχους EFABP και S100A10. Πιο συγκεκριμένα, η apoS100A7, φαίνεται να αλληλεπιδρά με την EFABP, στο διάλυμα, αλλά δυσκολίες στην καταγραφή των δισδιάστατων φασμάτων δεν έκαναν δυνατή την ταυτοποίηση των αλληλεπιδράσεων αλλά και τον προσδιορισμό της τρισδιάστατης δομής του συμπλόκου apoS100A7/EFABP. Από την άλλη μεριά, η αλληλεπίδραση της apoS100A7 με την apoS100A10, ήταν εμφανής όταν διαλύματα των δύο πρωτεϊνών αναμίχτηκαν. Αυτή ίσως να εμπλέκει την καταστροφή του ομοδιμερούς της S100A7 και την δημιουργία του ετεροδιμερούς S100A7/S100A10. Πιστεύουμε ότι κάθε πληροφορία σχετικά με τη δομή, την εξειδικευμένη λειτουργία και τις αλληλεπιδράσεις με άλλες πρωτεΐνες στόχους, για τις πρωτεΐνες αυτές, αποτελεί εξαιρετικό εργαλείο στην κλινική διάγνωση ή/και θεραπεία των, σχετιζόμενων με τις S100 πρωτεΐνες, ασθενειών.