Μελέτη των απλότυπων της λεκτίνης που δεσμεύει τη μαννόζη (mannose binding lectin, MBL) στον ελληνικό πληθυσμό και σε ασθενείς με λοιμώξεις

Abstract

The human defense system comprises of two distinct types of immunity: The innate (non-specific) immunity and the acquired (adaptive) immunity. The innate immunity is characterized by several unique features: rapid onset of action, existence independently to infection, recognition based on PAMPs (pathogen associated molecular patterns), non-clonal distribution and genetically pre-determined and inherited receptor specificity. It encompasses a variety of mechanisms, including anatomic and physiologic barriers, cellular elements and humoral factors such as the mannose-binding lectin (MBL). The term lectin is an, extremely wide, functional definition, including any molecule that possesses the ability to recognize and bind carbohydrates without any enzymatic activity towards them. In many members of this family, the lectinic function is served by a specific part of their molecule which is called carbohydrate recognition domain (CRD). Mannose-binding lectin belongs to the C-type subfamily (where the term C-type denotes the calcium dependency of the group) and more specifically to the collectins, which are C-type lectins with a collagen-like domain in their structure. MBL is a molecule, oligomeric in nature. The primary polypeptide chain consists of 228 amino-acids and can be divided into four structurally and functionally distinct domains: The N-terminal, the collagen-like, the “neck” and the CRD. These chains are joined together to form the basic (trimeric) subunits. These subunits undergo further oligomerization and form the circulating molecules which may be 2-mers to 6-mers. The serum levels are measured by ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay), exhibit age-dependency and have been shown to variate significantly in the general population. The gene for encoding for MBL (MBL2) is located on chromosome 10 and consists of 4 exons (ex1, ex2, ex3 και ex4, sized 187, 117, 69 και 371 bp respectively) and three introns (int1, int2 και int3, sized 662, 1354 and 732 bp respectively). The 1032 bp region upstream of the 5’ UTR includes the promoter. The main site of production for MBL is the liver, although transcripts of MBL2 have been found in other tissues as well. MBL is considered to be an acute phase reactant, and several regulatory elements have been mapped in the promoter region. The MBL2 is a highly polymorphic gene. Six single nucleotide polymorphisms (SNPs), mainly, determine the circulating levels. Three are located in exon1: CD52 (allele D, CGT to TGT, arginine to cystein), CD54 (allele B, GGC to GAC, glycine to aspartic acid) and CD57 (allele C, GGA to GAA, glycine to glutamic acid). Three more are located on the promoter: -550 (H/L), -221 (Y/X) και +4 (P/Q). Due to their close proximity the 6 SNPs are in linkage disequilibrium and organized in seven haplotypes HYPA, HYPD, LXPA, LYPA, LYPB, LYQA and LYQC. HYPA, LYQA belong to “high producers ”, LYPA to “intermediate producers”, LXPA to “low producers” while HYPD, LYQC and LYPB lead to extremely low or undetectable MBL. The mutant alleles D, B and C (collectively The human defense system comprises of two distinct types of immunity: The innate (non-specific) immunity and the acquired (adaptive) immunity. The innate immunity is characterized by several unique features: rapid onset of action, existence independently to infection, recognition based on PAMPs (pathogen associated molecular patterns), non-clonal distribution and genetically pre-determined and inherited receptor specificity. It encompasses a variety of mechanisms, including anatomic and physiologic barriers, cellular elements and humoral factors such as the mannose-binding lectin (MBL). The term lectin is an, extremely wide, functional definition, including any molecule that possesses the ability to recognize and bind carbohydrates without any enzymatic activity towards them. In many members of this family, the lectinic function is served by a specific part of their molecule which is called carbohydrate recognition domain (CRD). Mannose-binding lectin belongs to the C-type subfamily (where the term C-type denotes the calcium dependency of the group) and more specifically to the collectins, which are C-type lectins with a collagen-like domain in their structure. MBL is a molecule, oligomeric in nature. The primary polypeptide chain consists of 228 amino-acids and can be divided into four structurally and functionally distinct domains: The N-terminal, the collagen-like, the “neck” and the CRD. These chains are joined together to form the basic (trimeric) subunits. These subunits undergo further oligomerization and form the circulating molecules which may be 2-mers to 6-mers. The serum levels are measured by ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay), exhibit age-dependency and have been shown to variate significantly in the general population. The gene for encoding for MBL (MBL2) is located on chromosome 10 and consists of 4 exons (ex1, ex2, ex3 και ex4, sized 187, 117, 69 και 371 bp respectively) and three introns (int1, int2 και int3, sized 662, 1354 and 732 bp respectively). The 1032 bp region upstream of the 5’ UTR includes the promoter. The main site of production for MBL is the liver, although transcripts of MBL2 have been found in other tissues as well. MBL is considered to be an acute phase reactant, and several regulatory elements have been mapped in the promoter region. The MBL2 is a highly polymorphic gene. Six single nucleotide polymorphisms (SNPs), mainly, determine the circulating levels. Three are located in exon1: CD52 (allele D, CGT to TGT, arginine to cystein), CD54 (allele B, GGC to GAC, glycine to aspartic acid) and CD57 (allele C, GGA to GAA, glycine to glutamic acid). Three more are located on the promoter: -550 (H/L), -221 (Y/X) και +4 (P/Q). Due to their close proximity the 6 SNPs are in linkage disequilibrium and organized in seven haplotypes HYPA, HYPD, LXPA, LYPA, LYPB, LYQA and LYQC. HYPA, LYQA belong to “high producers ”, LYPA to “intermediate producers”, LXPA to “low producers” while HYPD, LYQC and LYPB lead to extremely low or undetectable MBL. The mutant alleles D, B and C (collectivelyreferred to as O, in contrast to the wild type which is denoted with A) are found in a rather high frequency all over the globe. In Caucasians, the O alleles have a cumulative frequency of 19-25%, with B being the most common. The consequences of the 6 SNPs do not involve only the amount but also the functionality of the produced molecule. It has been shown that the product of the mutant alleles is less able to form higher order oligomers and less potent in activating the complement pathway. MBL may recognize and bind to a variety of sugars, mainly mannose (the order reflects the strength of the chemical binding): N-acetyl-d-glucosamine (GlcNAc) > D-mannose/L-fucose > N- acetyl -mannosamine > maltose > glucose. Its ability to bind to the surface of microorganisms has been extensively studied. The major action of MBL, following recognition and binding, is the activation of the lectin-dependent pathway of complement which is a third, distinct from the classical and alternative pathways, mechanism, involving three serine proteases, known as MBL-associated serine proteases (MASPs). During the last 20 years it has been shown that MBL deficiency is related to susceptibility to infections. Among the clinical conditions that have been studied is meningococcal disease and septicemia in neonates. In several patients with low levels of circulating MBL and relapsing infections has been successfully administered human recombinant MBL. This study which was conducted at the Medical Genetics Laboratory (Choremio Research Center) of the Medical School Of Athens under the supervision of Prof. Emmanuel Kanavakis. We aimed to assess the distribution of the six SNPs of MBL2 in the general Greek population (371 persons), in patients with meningococcal disease (106 patients) and in neonates with urinary tract infections (122 neonates). For the purpose of this study we developed a microarray-based method for the genotypic characterization of the 6 SNPs. Throughout the analysis we used high throughput methods, including the BioRobot M48 workstation and Biorobot 3000 (Qiagen) for the extraction of DNA and the preparation of PCR reactions respectively, the Techne TC-412 thermal cycler for the performance of PCR reactions and the NanoChip 400 platform for the genotypic analysis. The NanoChip 400 is a fully automated platform applying the principles of hybridization on a microaaray basis. The characterization of each sample is based on the selective hybridization of two labeled probes, corresponding to the two alleles of a SNP, with the DNA strand on each pad of the array. Only the perfectly complementary probes will remain bind on the target strand in temperature close to the Tm. That way when a solution containing both probes is applied on the microarray and the temperature is set at the Tm of the probes, the fluorescence signal will correspond to the “wild”, “mutant” or “both”, depending on the genotype of the SNP. The basic principles of the method are as follows: The DNA fragments of interest are multiplied with PCR. The addressing of the PCR product is done on the “one sample” - “one pad of the microarray” basis and is achieved using electric current and stabilized through a biotin-streptavidin interaction . A solution containing both probes is applied on the array at temperature close to the Tm of the probes. After a short period of time, which allows the hybridization to take place, the solution is washed out, the temperature is lowered and the signal of each pad is measured. All probes for the 6 SNPs of MBL2 were designed according to the manufacturer’s instructions and guidelines. The hybridization was successful for all SNPs, with the exception of the +4 position in the meningitis and neonate population where a malfunction of the cartridge did not allow the measurement of the fluorescence sign. In the general Greek population the results were as follows: -550: H: 258/728 alleles (35.4%, 95% c.i.:32.0-39.0), L: 470/728 alleles (64.6%, 95% c.i.:61.0-68.0). -221: Y: 558/690 alleles (80.9%, 95% c.i.:77.7-83.7), X: 132/690 alleles (19.1%, 95% c.i.:16.3-22.3). +4: P: 526/690 alleles (76.2%, 95% c.i.:72.9-79.4), Q: 164/690 alleles (23.8%, 95% c.i.:20.6-27.1). CD52: A: 657/704 alleles (93.3%, 95% c.i.:91.2-95.0), D: 47/704 alleles (6.7%, 95% c.i.:4.9-8.8). CD54: A: 584/704 alleles (83.0%, 95% c.i.:80.0-85.6), B: 120/704 alleles (17.0%, 95% c.i.:14.3-20.0). CD52: A: 700/704 alleles (99.4%, 95% c.i.:98.6-99.8), C: 4/704 alleles (0.6%, 95% c.i.:0.2-1.4). The observed frequencies for SNPs -550 και -221 differed from the expected according to the Hardy-Weinberg equilibrium (p<0.05). The probability of a O/O genotype in the Greek population was 5.7% (95% c.i. 2.6-7.8%). In patients with meningococcal disease the frequency of every single SNP was comparable to the general population. The probability of a O/O genotype among patients with meningococcal disease was 7.5% (95% c.i. 2.6-7.8%) which is 1.5 times higher compared to the general population, although the result was not statistically significant (p=0.39). The distribution of the 6 SNPs of the MBL2 between neonates with urinary tract infection and the Greek population were similar. The probability of a neonate to carry two mutant alleles was 2.7% (95% c.i. 2.8-15.6%). In conclusion, in this study, a novel, microarray-based methodology was applied to characterize the 6 SNPs of the MBL2 on a large number of samples. The described technique is fast, cost-effective, reduces the probability of error and can be used for large scale studies. The observed frequencies of the 6 SNPs of the MBL2 in the Greek population are similar to those reported in the literature for Caucasians. No relation between the 6 SNPs of the MBL2 and meingococcal disease or urinary tract infection in neonates was found.

Η άμυνα του ανθρώπινου οργανισμού συνιστάται από δυο ξεχωριστούς τύπους ανοσίας: Την πρωταρχική γραμμή άμυνας (έμφυτη ανοσία, innate immunity) και την ειδική-επίκτητη ανοσία (adaptive immunity). Η έμφυτη ανοσία χαρακτηρίζεται από ταχεία ανταπόκριση, ύπαρξη προ της επαφής με τον ξένο παράγοντα, αναγνώριση μέσω “μοριακών μοτίβων σχετιζόμενων με παθογόνα”, (pathogen associated molecular patterns, PAMPs), απουσία κλωνικής κατανομής, ενώ τέλος, η ειδικότητα του υποδοχέα είναι κωδικοποιημένη στο γενετικό του υλικό και κληρονομείται αυτούσια στους απογόνους. Περιλαμβάνει ανατομικούς φραγμούς, φυσιολογικούς φραγμούς, κυτταρικά στοιχεία και χυμικά στοιχεία (μεταξύ των οποίων και η λεκτίνη που δεσμεύει τη μαννόζη (mannose binding lectin, MBL)). Οι λεκτίνες χαρακτηρίζονται από τη δυνατότητά τους να αναγνωρίζουν και να δεσμεύουν σακχαριδικές αλληλουχίες μέσω της περιοχή αναγνώρισης πολυσακχαρίτη (carbohydrate recognition domain, CRD) χωρίς να επιδεικνύουν οποιαδήποτε ενζυμική δράσης προς το αναγνωριζόμενο σάκχαρο. Η MBL ανήκει στις λεκτίνες C-τύπου και συγκεκριμένα στις κολλεκτίνες. Εμφανίζει μήκος 228 αμινοξέων και αποτελείται από τέσσερις διακριτές περιοχές: την αμινοτελική περιοχή, την περιοχή του κολλαγόνου, την περιοχή του αυχένα και την CRD. Η CRD εμφανίζει υψηλά διατηρημένη αλληλουχία μεταξύ των MBL του ζωικού βασιλείου. Η MBL εμφανίζει πολυμερή μορφή με τρεις πεπτιδικές αλυσίδες να σχηματίζουν τη βασική δομική υπομονάδα η οποία σχηματίζει τις ανώτερες μορφές (2μερή-6μερή). Τα επίπεδα της MBL στον ορό, τα οποία μετρώνται με ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay), εμφανίζουν ηλικιακή διακύμανση, εξαρτώνται από τη μεθοδολογία μέτρησης και παρουσιάζουν μεγάλος εύρος στο γενικό πληθυσμό. Το γονίδιο της MBL (MBL2) εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 10 και αποτελείται από τέσσερα εξόνια και τρία ιντρόνια. Το μέγεθος των εξονίων (ex1, ex2, ex3 και ex4) είναι 187, 117, 69 και 371 βάσεις αντίστοιχα, ενώ τα τρία ιντρόνια (int1, int2 και int3) έχουν μέγεθος 662, 1354 και 732 βάσεις αντίστοιχα. Η περιοχή σε έκταση 1032 βάσεων η οποία προηγείται της 5’ UTR περιλαμβάνει την περιοχή του προαγωγέα (promoter). Το εξόνιο 1 κωδικοποιεί το πεπτίδιο-σήμα, την αμινοτελική περιοχή και 7 τριπλέτες GLY_X_Y από την κολλαγονική περιοχή. Το εξόνιο 2 κωδικοποιεί 12 επιπλέον τριπλέτες GLY_X_Y καθώς και το πρώτο αμινοξύ της περιοχής του αυχένα. Το εξόνιο 3 κωδικοποιεί το αρχικό τμήμα της περιοχής του αυχένα και το εξόνιο 4 το εναπομείναν τμήμα του αυχένα και την CRD. Η κύρια θέση παραγωγής της MBL είναι το ήπαρ αλλά έχει ανιχνευθεί μεταγραφικό προϊόν και σε εξωηπατικούς ιστούς. Η MBL θεωρείται πρωτεΐνη οξείας φάσεως και έχουν διαπιστωθεί αρκετά ρυθμιστικά στοιχεία στην περιοχή του προαγωγέα. Το MBL2 είναι υψηλά πολυμορφικό γονίδιο. Έξι πολυμορφισμοί ευθύνονται κατά κύριο λόγο για τα επίπεδα της κυκλοφορούσας πρωτεΐνης. Τρεις εντοπίζονται στην περιοχή του προαγωγέα: -550 (H/L), -221 (Y/X) και +4 (P/Q). Τρεις επιπλέον θέσεις σημειακών μεταλλάξεων εντοπίζονται στο εξόνιο 1: στο κωδικόνιο 52 (CD52, αλλήλιο D, CGT σε TGT), οδηγώντας σε αντικατάσταση αργινίνης από κυστεΐνη, στο κωδικόνιο 54 (CD54, αλλήλιο B, GGC σε GAC) οδηγώντας σε αντικατάσταση γλυκίνης από ασπαρτικό οξύ και στο κωδικόνιο 57 (CD57, αλλήλιο C, GGA σε GAA) οδηγώντας σε αντικατάσταση γλυκίνης από γλουταμικό οξύ. Τα 6 αυτά SNPs λόγω της κοντινής τους απόστασης οργανώνονται σε 7 διακριτούς απλοτύπους: HYPA, HYPD, LXPA, LYPA, LYPB, LYQA και LYQC. Οι HYPA, LYQA ανήκουν στους υψηλούς “παραγωγούς”, ο LYPA στους “ενδιάμεσους”, ο LXPA στους χαμηλούς “παραγωγούς”, και οι HYPD, LYQC και LYPB στους απλότυπους με σχεδόν ανύπαρκτη παραγωγή MBL. Τα αλλήλια Ο (D ή B ή C) εμφανίζουν υψηλή συχνότητα σχεδόν σε όλους τους πληθυσμούς που έχουν μελετηθεί. Στους Καυκάσιους πληθυσμούς αθροιστικά φθάνουν στο 19-25% με το αλλήλιο B να είναι το συχνότερο (12-15%). Οι συνέπειες των 6 SNPs αφορούν όχι μόνο τη ποσότητα της παραγόμενης MBL αλλά και τη λειτουργική της επάρκεια καθώς πιθανά οι μορφές που παράγονται δεν σχηματίζουν ανώτερα ολιγομερή και δεν ενεργοποιούν επαρκώς το συμπλήρωμα. Εκτός από το MBL2, στο χρωμόσωμα 10 εντοπίζεται και το ψευδογονίδιο MBL1P1 το οποίο μεταγράφεται μεν αλλά δεν παράγει ανιχνεύσιμο προϊόν σε σημαντικές ποσότητες. Η MBL αναγνωρίζει, με σειρά ισχύος δεσμού τα εξής σάκχαρα: N-ακέτυλ-d-γλυκοζαμίνη (GlcNAc) > D-μαννόζη/L-φουκόζη > N-ακέτυλ-μαννοζαμίνη > μαλτόζη > γλυκόζη. Η δυνατότητα της MBL να συνδέεται στην επιφάνεια μικροοργανισμών (μικροβίων, μυκήτων και ιών) έχει μελετηθεί ευρύτατα. Η βασική της δράση είναι η ενεργοποίηση της λεκτινο-εξαρτώμενης οδού του συμπληρώματος η οποία αποδείχθηκε ότι σχετίζεται με τρεις C1r/C1s-παρόμοιες πρωτεάσες που περιέχουν σερίνη, οι οποίες ονομάζονται MBL σχετιζόμενες σερινο-πρωτεάσες (MBL-associated serine proteases, MASPs). Σε μικρότερο βαθμό έχει δράσεις άμεσης οψωνίνης, ενώ συμμετέχει στην εκκαθάριση κυττάρων “αλλοιωμένου εαυτού” και στην ανοσορρύθμιση του οργανισμού. Τα τελευταία 20 χρόνια έχει διαπιστωθεί ότι η έλλειψη MBL προδιαθέτει στην εμφάνιση λοιμώξεων και έχει μελετηθεί εκτεταμένα σε ποικιλία κλινικών καταστάσεων. Μεταξύ αυτών έχει συσχετισθεί η ομοζυγωτία για δυο O αλλήλια με την εμφάνιση μηνιγγιτιδοκοκκικής νόσου, καθώς και τα χαμηλά επίπεδα MBL με τη εμφάνιση σηψαιμίας κατά τη νεογνική περίοδο. Επιπλέον έχει χορηγηθεί με επιτυχία γενετικά ανασυνδυασμένη, ανθρώπινη MBL σε άτομα με ευπάθεια σε λοιμώξεις και πολύ χαμηλά επίπεδα στον ορό. Σε αυτή τη μελέτη, η οποία πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής του Πανεπιστημίου Αθηνών, στο Χωρέμειο Ερευνητικό Εργαστήριο, υπό την εποπτεία του Καθηγητή Ιατρικής Γενετικής Εμμανουήλ Καναβάκη, αναλύθηκαν οι 6 πολυμορφισμοί του γονιδίου MBL2 στο γενικό Ελληνικό πληθυσμό (371 άτομα), σε ασθενείς με μηνιγγιτιδοκοκκική νόσο (106 άτομα) και σε νεογνά με ουρολοίμωξη (122 νεογνά). Οι ασθενείς με μηνιγγιτιδοκοκκική νόσο προήλθαν από τη Μονάδα Λοιμώξεων “ΜΑΚΚΑ” της 1ης Παιδιατρικής Κλινικής του Πανεπιστημίου Αθηνών (υπό τη διεύθυνση της κυρίας Θεοδωρίδου, Καθηγήτριας Παιδιατρικής) και από το Εθνικό Εργαστήριο Αναφοράς Μηνιγγίτιδος της Εθνικής Σχολής Δημόσιας Υγείας (υπό τη διεύθυνση της κυρίας Τζανακάκη). Δείγματα νεογνών με ουρολοίμωξη προήλθαν από τη Μονάδα Αυξημένης Φροντίδας Νεογνών της 1ης Παιδιατρικής Κλινικής του Πανεπιστημίου Αθηνών (υπό τη διεύθυνση της κυρίας Σιαχανίδου, Επίκουρης Καθηγήτριας Παιδιατρικής Νεογνολογίας). Η μελέτη χρηματοδοτήθηκε από την Ακαδημία Αθηνών. Υπεύθυνος του έργου (κωδικός: 200/624) ήταν ο Γραμματέας της Ακαδημίας Αθηνών, Νικόλαος Ματσανιώτης. Για την ανάλυση χρησιμοποιήθηκαν τεχνικές ταυτόχρονης ανάλυσης μεγάλου αριθμού δειγμάτων (“high throughput”). Για την απομόνωση του DNA και την προετοιμασία των αντιδράσεων PCR χρησιμοποιήθηκαν η πλατφόρμες BioRobot M48 workstation και Biorobot 3000 της εταιρείας Qiagen αντίστοιχα. Για την πραγματοποίηση των PCRs χρησιμοποιήθηκε ο θερμικός κυκλοποιητής Techne TC-412. Ο γονοτυπικός χαρακτηρισμός των έξι πολυμορφικών θέσεων στο MBL2 των πραγματοποιήθηκε στην πλατφόρμα μικροσυστοιχιών (microarrays) NanoChip 400 της εταιρείας Nanogen. Στη μεθοδολογία αυτή, η οποία στηρίζεται στη θεωρία του υβριδισμού, χρησιμοποιείται μια ηλεκτρονική μικροσυστοιχία πολλαπλών θέσεων και στηρίζεται στην αυτοματοποιημένη ανίχνευση του σήματος υβριδισμού σε κάθε ξεχωριστή θέση. Κάθε θέση της μικροσυστοιχίας περιέχει δείγμα από ένα μόνο άτομο και ο υβριδισμός πραγματοποιείται χρησιμοποιώντας δυο διαφορετικά, σημασμένα με διαφορετικό φθορίζον μόριο, ολιγονουκλεοτίδια που είναι συμπληρωματικά προς τα δυο αλλήλια της πολυμορφικής θέσης. Η αναλογία του σήματος που ανιχνεύεται σε κάθε θέση καθορίζει τον γονότυπο του δείγματος για τον συγκεκριμένο πολυμορφισμό. Η όλη διαδικασία αποτελείται από τα εξής βήματα: 1ο) Συλλογή των δειγμάτων από τους συμμετέχοντες, 2ο) Απομόνωση του DNA (DNA extraction), 3ο) Πολλαπλασιασμός των τμημάτων που περιέχουν τους υπό διερεύνηση πολυμορφισμούς με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης, 4ο) Ανάμιξη των προϊόντων PCR για κάθε συμμετέχοντα, 5o) Προετοιμασία της μικροσυστοιχίας (cartridge), 6ο) Προετοιμασία της πλακέτας πολλαπλών θέσεων, 7ο) Αντιστοίχηση (addressing) κάθε δείγματος σε μια θέση της μικροσυστοιχίας και 8ο) Υβριδισμός με τα δυο σημασμένα ολιγονουκλεοτίδια, μέτρηση του σήματος σε κάθε θέση της μικροσυστοιχίας και καθορισμός του γονοτύπου. Σχεδιάστηκαν τρία προϊόντα PCR που είχαν μήκος 112, 324 και 131 bp και περιελάμβαναν το πρώτο τη θέση -550, το δεύτερο τις θέσεις -221 και +4 και το τρίτο τις θέσεις CD52, CD54 και CD57. Οι ανιχνευτές για τον υβριδισμό σχεδιάστηκαν σύμφωνα με τις προδιαγραφές του κατασκευαστή. Οι 6 πολυμορφικές θέσεις χαρακτηρίστηκαν με επιτυχία με εξαίρεση τη θέση +4 στους ασθενείς με μηνιγγιτιδοκοκκική νόσο και στα νεογνά με ουρολοίμωξη όπου λόγω τεχνικού προβλήματος στη μικροσυστοιχία δεν κατέστη δυνατός ο υβριδισμός. Όσον αφορά το γενικό πληθυσμό τα αποτελέσματα είχαν ως εξής: -550: H: 258/728 αλλήλια (35.4%, 95% c.i.:32.0-39.0), L: 470/728 αλλήλια (64.6%, 95% c.i.:61.0-68.0). -221: Y: 558/690 αλλήλια (80.9%, 95% c.i.:77.7-83.7), X: 132/690 αλλήλια (19.1%, 95% c.i.:16.3-22.3). +4: P: 526/690 αλλήλια (76.2%, 95% c.i.:72.9-79.4), Q: 164/690 αλλήλια (23.8%, 95% c.i.:20.6-27.1). CD52: A: 657/704 αλλήλια (93.3%, 95% c.i.:91.2-95.0), D: 47/704 αλλήλια (6.7%, 95% c.i.:4.9-8.8). CD54: A: 584/704 αλλήλια (83.0%, 95% c.i.:80.0-85.6), B: 120/704 αλλήλια (17.0%, 95% c.i.:14.3-20.0). CD52: A: 700/704 αλλήλια (99.4%, 95% c.i.:98.6-99.8), C: 4/704 αλλήλια (0.6%, 95% c.i.:0.2-1.4). Οι συχνότητες διέφεραν από τις προβλεπόμενες από την ισορροπία Hardy-Weinberg στις θέσεις -550 και -221 (p<0.05). Η πιθανότητα ένα άτομο του Ελληνικού πληθυσμού να φέρει δυο απλότυπους οι οποίοι να παράγουν σχεδόν μηδενική ΜΒL (ομοζυγώτες και διπλοί ετεροζυγώτες LYPB, LYQC, HYPD) είναι 5.7% (95% c.i. 2.6-7.8%). Στους ασθενείς με μηνιγγιτιδοκοκκική νόσο οι συχνότητες των επιμέρους πολυμορφισμών ήταν συγκρίσιμες με του γενικού πληθυσμού. Η πιθανότητα ένα άτομο με μηνιγγιτιδοκοκκική νόσο να φέρει δυο απλότυπους οι οποίοι να παράγουν σχεδόν μηδενική ΜΒL είναι 7.5% (95% c.i. 2.8-15.6%) το οποίο είναι 1.5 φορές μεγαλύτερο από το γενικό πληθυσμό, αν και η διαφορά αυτή δεν ήταν στατιστικά σημαντική (p=0.39). Στα νεογνά με ουρολοίμωξη oι συχνότητες των επιμέρους πολυμορφισμών ήταν, επίσης, συγκρίσιμες με του γενικού πληθυσμού. Η πιθανότητα ένα νεογνό με ουρολοίμωξη να φέρει δυο απλότυπους οι οποίοι να παράγουν σχεδόν μηδενική ΜΒL είναι 2.7% (95% c.i. 2.8-15.6%), ποσοστό συγκρίσιμο με αυτό του γενικού πληθυσμού. Συμπερασματικά, στην εργασία αυτή εφαρμόστηκαν με επιτυχία τεχνικές “high-throughput” στην ανίχνευση των 6 πολυμορφισμών του MBL2 και για πρώτη φορά στη βιβλιογραφία εφαρμόστηκε η μεθοδολογία των μικροσυστοιχιών για το γονοτυπικό χαρακτηρισμό αυτού του γονιδίου. Οι συχνότητες των 6 SNPs στον Ελληνικό πληθυσμό είναι συγκρίσιμες με αυτές άλλων Καυκάσιων πληθυσμών και επιβεβαιώνεται η υψηλή συχνότητα αλληλίων και γονοτύπων που σχετίζονται με χαμηλά επίπεδα MBL. Σε ασθενείς με μηνιγγιτιδοκοκκική νόσο διαπιστώθηκε διπλάσια συχνότητα γονοτύπων που οδηγούν σε ανεπάρκεια MBL σε σχέση με το γενικό πληθυσμό αν και το αποτέλεσμα δεν ήταν στατιστικά σημαντικό. Σε νεογνά με ουρολοίμωξη δεν βρέθηκαν σημαντικές αποκλίσεις από το γενικό πληθυσμό.