Κλωνοποίηση, έκφραση και διερεύνηση των ανοσοβιολογικών ιδιοτήτων των πρωτεϊνών core/core+1 του ιού της ηπατίτιδας C

Abstract

Hepatitis C virus (HCV) is a member of Ηepacivirus genus within the Flaviviridae family. It infects the human liver and is a major cause of acute and chronic hepatitis, which in turn leads to severe liver diseases, such as chronic active hepatitis, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma (HCC). An estimated 170 million people (3% of world population) is infected by HCV. Comparison of nucleotide sequence data has led to the classification of HCV into six major types (genotypes) that differ from each other by 30% over the entire genome and several closely related subtypes that differ from each other by around 20%. Genotypes 1, 2 and 3 are spread worldwide. In Western Europe, HCV genotype 1 is the most prevalent genotype in individuals aged over 40 years, whereas genotype 3 is mostly common in young people, especially in intravenous drug users. In Greece, HCV genotype 1 is the most prevalent (46.9%), followed by genotype 3 (28.1%), 4 (13.2%), 2 (6.9%) and 5 (0.4%). Moreover, a sharp (13-fold) increase for genotype 3 was observed from 1970 to 1990, suggesting that genotype 3 and intravenous drug use are the major forces for HCV epidemic in the recent cohort of HCV-infected individuals in Greece. Although there is no vaccine or broadly effective therapy, treatment of HCV infection with standard combination therapy, which includes pegylated interferon-a (Peg-IFN-a-2a) plus ribavirin, has an overall estimated success rate of 50% for genotype 1 and about 80% for genotype 2 and 3. Viral load of less than 600,000 IU/mL at the beginning of the therapy is also a major predictor of a sustained virological response (SVR). Host factors such as age, race, gender, obesity and degree of hepatic fibrosis, also affect the chance of an SVR. HCV genome consists of a 9.6 kb single-strand, positive-sense RNA, which encodes for a single immature polyprotein of about 3,000 amino acids. This translation product is cleaved by cellular and viral proteases to yield at least four structural (C, E1, E2, p7) and six non structural (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B) mature proteins. Recent studies by different groups of investigators, have provided strong evidence for the presence of a functional alternative open reading frame (ORF) within the core genomic region in the +1 reading frame (known as ARF or core+1 ORF), that leads to the production of ‘core overlapping’ peptides known as alternative reading frame proteins (ARFPs) or frameshift (F) or core+1 proteins. Since its discovery, different isoforms of ARF/core+1 protein have been reported based on differences in the translation initiation mechanism that are found to stimulate expression of ARF/core+1 ORF in cultured cells. The biological significance of the ARF/core+1 expression remains elusive. However, several studies imply the presence of this protein in HCV patients via its specific recognition by serum antibodies (anti-ARF/core+1 Abs). Some of these studies suggest a correlation between the presence of anti ARF/core+1 Abs and specific stages of HCV infection, such as the latest stages of liver steatosis and hepatocellular carcinoma (HCC). In the present study we estimated the prevalence of specific anti-ARF/core+1 Abs in HCV infected patients belonging to genotypes 1a/1b or 3a, treated with Peg-IFN-a-2a plus ribavirin and its association with patients’ age and HCV-RNA levels at baseline. The anti-ARF/core+1 Ab’s titer dynamics during therapy follow up were also investigated. For these purposes, highly purified HCV core and ARF/core+1 recombinant proteins were expressed in Escherichia coli. Using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), we assessed the prevalence of anti-ARF/core+1 antibodies in 90 chronic hepatitis C patients. Samples derived from 92 healthy blood donors were used as negative controls. All HCV-RNA positive serum samples reacted with core 1a antigen while 15 (37.5%) out of 40 and 14 (28%) out of 50 patients infected with HCV-1a/1b and HCV-3a respectively, were found to have anti-ARF/core+1 antibodies into their serum before treatment initiation. These antibodies were persistently present during treatment follow up and linked to elevated levels of HCV RNA at baseline.

O ιός της ηπατίτιδας C (HCV) είναι μέλος του γένους των Hepacivirus που ανήκουν στην οικογένεια Flaviviridae. Μολύνει το ανθρώπινο ήπαρ και είναι μία κύρια αιτία οξείας και χρόνιας ηπατίτιδας, η οποία κατά περιπτώσεις οδηγεί σε σοβαρές ηπατικές ασθένειες, όπως χρόνια ενεργό ηπατίτιδα, κίρρωση και ηπατοκυτταρικό καρκίνο (HCC). Περίπου 170 εκατομμύρια άνθρωποι (3% του παγκόσμιου πληθυσμού) έχουν μολυνθεί από τον HCV. H σύγκριση δεδομένων νουκλεοτιδικών αλληλουχιών έχει οδηγήσει στην κατηγοριοποίηση του HCV σε έξι κύριους τύπους (γονότυπους) που διαφέρουν μεταξύ τους κατά 30% σε ολόκληρο το γονιδίωμά τους, σε αρκετούς συγγενικούς υπότυπους που διαφέρουν μεταξύ τους περίπου 20%. Οι γονότυποι 1, 2, και 3 έχουν παγκόσμια διασπορά. Στην Δυτική Ευρώπη ο γονότυπος 1 είναι ο πιο διαδεδομένος σε άτομα άνω των 40 ετών, ενώ ο γονότυπος 3 είναι ο πιο διαδεδομένος ανάμεσα σε νεαρά άτομα και ειδικότερα στους χρήστες ενδοφλέβιων ουσιών. Στην Ελλάδα, ο γονότυπος 1 είναι ο πιο διαδεδομένος (46.9%), ενώ ακολουθεί ο γονότυπος 3 (28.1%), 4 (13.2%), 2 (6.9%), και 5 (0.4%). Επιπρόσθετα, μία απότομη αύξηση του γονότυπου 3 σε χρήστες ενδοφλέβιων ουσιών παρατηρήθηκε μεταξύ του 1970 και 1990, προτείνοντας ότι ο γονότυπος 3 και οι χρήστες ενδοφλέβιων ουσιών είναι οι κινητήριες δυνάμεις της επιδημίας του HCV στον Ελληνικό πληθυσμό. Παρότι δεν υπάρχει εμβόλιο ή ευρέως αποτελεσματική θεραπεία για την λοίμωξη από τον HCV, η συνδυαστική θεραπεία με πεγκυλιωμένη ιντερφερόνη-a (Peg-IFN-a-2a) και ριμπαβιρίνη, έχει μία συνολική αποτελεσματικότητα γύρω στο 50% για τον γονότυπο 1 και γύρω στο 80% για τους γονότυπους 2 και 3. To χαμηλό ιϊκό φορτίο (<600,000 IU/mL) κατά την εκκίνηση της θεραπείας είναι επίσης ένας κύριος προγνωστικός δείκτης μίας παρατεταμένης ιικής ανταπόκρισης (SVR). Παράγοντες που αφορούν τον ξενιστή όπως η ηλικία, η φυλή, η ηπατική ίνωση επίσης επηρεάζουν την ανταπόκριση στην θεραπεία. Το γονιδίωμα του HCV αποτελείται από ένα θετικής πολικότητας μονόκλωνο μόριο RNA μήκους 9.6kb το οποίο κωδικοποιεί για μια πολυπρωτεΐνη μήκους 3.000 αμινοξέων. Το μεταφραστικό αυτό προϊόν πρωτεολύεται από κυτταρικές και ιϊκές πρωτεάσες και έτσι παράγει τουλάχιστον τέσσερις δομικές (C, E1, E2, p7) και έξι μη δομικές (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B) ώριμες πρωτεΐνες. Πρόσφατες μελέτες από ανεξάρτητες ομάδες ερευνητών, έχουν φέρει στο φως ισχυρές ενδείξεις για την παρουσία ενός λειτουργικού εναλλακτικού πλαισίου ανάγνωσης (ORF) μέσα στην γονιδιακέ περιοχή core, στο +1 πλαίσιο ανάγνωσης (γνωστό ως ARF ή core+1 ORF), που οδηγεί στην παραγωγή ‘core-επικαλυπτόμενων’ πεπτιδίων γνωστών ως πρωτεΐνες εναλλακτικού πλαισίου ανάγνωσης (ARFPs) ή frameshift (F) ή core+1 πρωτεΐνες. Από την ανακάλυψη της μέχρι σήμερα, διάφορες ισομορφές της ARF/core+1 έχουν περιγραφεί, κυρίως λόγω ύπαρξης διαφορετικών μηχανισμών έναρξης της μετάφρασης που έχουν βρεθεί να επάγουν το ARF/core+1 πλαίσιο ανάγνωσης σε καλλιεργούμενα κύτταρα. Η βιολογική σημασία της έκφρασης της ARF/core+1 παραμένει αδιευκρίνιστη. Παρόλα αυτά, αρκετές μελέτες καταδεικνύουν την ύπαρξη αυτής της πρωτεΐνης σε ασθενείς με λοίμωξη από τον HCV, μέσω αναγνώρισής της από αντισώματα του ορού (anti-ARF/core+1 Abs). Κάποιες από αυτές τις μελέτες προτείνουν μία συσχέτιση της παρουσίας αυτών των αντισωμάτων με συγκεκριμένα στάδια της λοίμωξης από τον HCV, όπως τα τελικά στάδια ηπατικής στεάτωσης και τον ηπατοκυτταρικό καρκίνο (HCC). Στην παρούσα μελέτη εξετάσαμε την παρουσία ειδικών anti-ARF/core+1 αντισωμάτων σε ασθενείς που είχαν μολυνθεί από τον ιό HCV γονότυπου 1a/b ή 3a, και είχαν ακολουθήσει θεραπεία με Peg-IFN-a-2a και ριμπαβιρίνη, καθώς και την συσχέτισή τους με την ηλικία των ασθενών και τα επίπεδα του HCV RNA πριν την έναρξη της θεραπείας. Μελετήθηκε επίσης δυναμική του τίτλου των anti-ARF/core+1 αντισωμάτων κατά την διάρκεια του follow up της θεραπείας. Για τον σκοπό της μελέτης, υψηλής καθαρότητας HCV core και ARF/core+1 ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες εκφράστηκαν σε βακτήρια Escherichia coli. Χρησιμοποιώντας την ανοσοενζυμική μέθοδο ELISA, μελετήσαμε την παρουσία των anti-ARF/core+1 αντισωμάτων σε 90 χρόνιους ασθενείς. Δείγματα πλάσματος από 92 υγιή άτομα χρησιμοποιήθηκαν σαν αρνητικά control. Όλοι οι HCV-RNA θετικοί οροί αντέδρασαν με το core 1a αντιγόνο, ενώ 15 (37.5%) από τους 40 και 14 (28%) από τους 50 ασθενείς που είχαν μολυνθεί από την ιό HCV-1a/1b και HCV-3a αντίστοιχα, βρέθηκε να έχουν anti-ARF/core+1 αντισώματα στον ορό τους πριν την έναρξη της θεραπείας. Αυτά τα αντισώματα ήταν παρόντα καθ’ όλη την διάρκεια της θεραπείας, και συνδέονταν με αυξημένα επίπεδα HCV-RNA σε αυτούς τους ασθενείς.