Τροποποιητικά μόρια φυσικής ανοσίας σε κλινικά μοντέλα νόσων

Abstract

Autoinflammatory syndromes are a group of inflammatory disorders characterized by defective function of innate immune system. The term IL-1β-dependent autoinflammatory disorder is used for a subgroup of these syndromes, characterized by excessive IL-1β production due to NLRP3 inflammasome activation. Familial Mediterranean fever (FMF) is the most common member of the genetically defined autoinflammatory syndromes. Periodic, inflammatory bouts are the manifestation of this disorder, while metabolic stress is often a predisposing factor for the initiation of disease attacks. Moreover, gout is the most common autoinflammatory disorder, characterized by innate immune activation by monosodium urate crystals. In the present study, we investigated the implication of innate immunity, and especially IL-1β, in the pathogenesis of these disorders. The involvement of IL-1β in the initiation of FMF attacks was demonstrated by the therapeutic effect of on demand administration of anakinra in a patient with colchicine resistant FMF. Moreover, administration of canakinumab, an anti-IL-1β monoclonal antibody, resulted in the restriction of chronic inflammation of FMF in a patient with destructive arthritis. In the experimental part of this study, we investigated the implication of innate immunity in the pathogenesis of FMFand gout. It was demonstrated that mTOR inhibition, a master regulator of cellular metabolic status, results in the downregulation of pyrin expression, the protein mutated in FMF, in neutrophils from attack-free FMF patients. However, pyrin levels were not altered in control neutrophils after mTOR inhibition. This was associated with the upregulation of MEFV mRNA levels. This homeostatic mechanism was not operative in neutrophils from FMF patients. These data provide a linkage between metabolic pathways and FMF neutrophil functions. In addition, neutrophil autophagy was studied and was associated with FMF phenotype. Basal autophagy is a homeostatic mechanism for the concervation of cellular integrity. Recently autophagy has been implicated in innate immune functions, including pathogen recognition and elimination. In the present study, we demonstrated low levels of basal autophagy in neutrophils from FMF patients, as assessed by LC3B immunoblotting and ATG gene expression. In the last part of this study, it was demonstrated the release of neutrophil extracellular traps (NETs) by peripheral blood neutrophils and synovial fluid cells. Moreover, NET formation was detected after treatment of control neutrophils with monosodium urate crystals or synovial fluid. The involvement of IL-1β in this process was demonstrated by ex vivoinhibition studies, using anakinra. Considering that the improper NET relese causes tissue damage, the intra-articular release of these formations may be implicated in the pathogenesis of acute gout.

Τα αυτοφλεγμονώδη σύνδρομα αποτελούν μια ξεχωριστή ομάδα φλεγμονωδών νοσημάτων, που χαρακτηρίζονται από δυσλειτουργία του συστήματος της φυσικής ανοσίας. Μια υποκατηγηγορία της ομάδας αυτής είναι τα σχετιζόμενα με την IL-1β αυτοφλεγμονώδη σύνδρομα, με κύριο χαρακτηριστικό τους την υπερπαραγωγή της IL-1β λόγω ενεργοποίησης του φλεγμονοσώματος της κρυοπυρίνης. Ο οικογενής Μεσογειακός πυρετός (FMF) αποτελεί τη συχνότερη γενετικά καθοριζόμενη νόσο της κατηγορίας αυτής και εκδηλώνεται με φλεγμονώδης κρίσεις που επάγονται συχνά από μεταβολικούς στρεσογόνους παράγοντες. Από την άλλη η ουρική αρθρίτιδα αποτελεί την πιο συχνή μη γενετικά καθοριζόμενη αυτοφλεγμονώδη πάθηση, με κύριο χαρακτηριστικό της την ενεργοποίηση της φυσικής ανοσίας από τους κρυστάλλους του ουρικού νατρίου. Στην παρούσα μελέτη διερευνήθηκε η συσχέτιση της φυσικής ανοσίας, και κυρίως ο ρόλος της IL-1β, στην παθογένεση των δύο αυτών συνδρόμων. Σε κλινικό επίπεδο διαπιστώθηκε αρχικά η συμμετοχή της IL-1β στην έναρξη των κρίσεων του FMF, μέσω της επιτυχούς κατ’ επίκληση χορήγησης anakinra, του ανασυνδυασμένου ανταγωνιστή της IL-1, με την έναρξη των συμπτωμάτων. Επιπλέον, ο περιορισμός της χρόνιας φλεγμονώδους δραστηριότητας με τη χορήγηση canakinumab, μονοκλωνικού αντισώματος κατά της IL-1β, σε ασθενή με καταστροφική αρθρίτιδα και FMF φανέρωσε τον εν γένει παθογενετικό ρόλο της κυτταροκίνης στη νόσο. Στο πειραματικό μέρος της μελέτης, διερευνήθηκε η συμβολή διαφόρων λειτουργιών της φυσικής ανοσίας στην παθογένεση του FMF και της ουρικής αρθρίτιδας. Διαπιστώθηκε ότι η αναστολή του mTOR, ο οποίος αποτελεί κεντρικό ρυθμιστή της ενεργειακής κατάστασης του κυττάρου, προκαλεί ελάττωση των επιπέδων της πυρίνης, της πρωτεΐνης που βρίσκεται μεταλλαγμένη στη νόσο, στα ουδετερόφιλα των ασθενών με FMF. Αντίθετα, στα αντίστοιχα κύτταρα υγειών εθελοντών δε διαπιστώθηκε μεταβολή στην έκφρασή της, γεγονός που συνδιάστηκε με την υπερέκφραση του γονιδίου MEFV, που την κωδικοποιεί. Ο ομοιοστατικός αυτός μηχανισμός δε λειτούργησε στα κύτταρα των ασθενών. Διαπιστώθηκε, με τον τρόπο αυτό, μια πιθανή σύνδεση μεταβολικών μονοπατιών με τη λειτουργία του ουδετερόφιλου στον FMF. Στη συνέχεια μελετήθηκε ο μηχανισμός της αυτοφαγίας στο ουδετερόφιλο και η πιθανή συσχέτιση με τον FMF. Η βασική αυτοφαγία αποτελεί ομοιοστατικό μηχανισμό, ο οποίος διατηρεί σταθερές τις ενδοκυττάριες συνθήκες. Επιπλέον, διεγείρεται για τον ίδιο σκοπό σε καταστάσεις ενεργειακού κινδύνου. Τελευταία συσχετίσθηκε με βασικές λειτουργίες της φυσικής ανοσίας συμπεριλαμβανομένων της αναγνώρισης και κάθαρσης παθογόνων μικροοργανισμών. Στην παρούσα μελέτη, αφού μελετήθηκε η επαγωγή της αυτοφαγίας στα φυσιολογικά ουδετερόφιλα από φλεγμονώδη ερεθίσματα, διαπιστώθηκαν χαμηλά επίπεδα βασικής αυτοφαγίας στα ουδετερόφιλα των ασθενών με FMF, με τη μελέτη της μετατροπής της πρωτεΐνης LC3B στην αυτοφαγοσωματική της μορφή αλλά και με τη μελέτη της έκφρασης των σχετιζόμενων με τη λειτουργία αυτή γονιδίων ATG. Στο τελευταίο μέρος της μελέτης, διαπιστώθηκε η παραγωγή εξωκυττάριων δικτύων χρωματίνης από ουδετερόφιλα τόσο της προσβεβλημένης άρθρωσης όσο και της περιφέρειας ασθενών με ουρική αρθρίτιδα, ενώ παράλληλα το φαινόμενο αναπαράχθηκε σε φυσιολογικά ουδετερόφιλα μετά από διέγερση με αρθρικό υγρό, ορό ασθενών ή κρυστάλλους ουρικού οξέος. Η συμμετοχή της IL-1β στο φαινόμενο διαπιστώθηκε με ex vivo αναστολή με τη χρήση anakinra. Ο προτεινόμενος ρόλος της απελευθέρωσης των δικτύων αυτών στην πρόκληση ιστικής βλάβης και φλεγμονής συνηγορεί στην πιθανή συμμετοχή του περιγραφόμενου μηχανισμού στην παθογένεση της ουρικής αρθρίτιδας.