Απομόνωση, φαινοτυπικός και μοριακός χαρακτηρισμός των μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων του αμνιακού υγρού: σύκριση με βλαστικά μεσεγχυματικά κύτταρα του μυελού των οστών και του αίματος ομφαλίου λώρου, σε πρωτεωμικό επίπεδο

Abstract

Human mesenchymal stem cells (MSCs) are considered to be of great promise for use in tissue repair and regenerative medicine as well as in cell based therapies for cancer treatment. In the present thesis we identified and characterized human second trimester amniotic fluid (AF) as a novel source of MSCs. Herein, we found that early colonies of AF, MSCs consisted of two morphologically distinct cell types termed as spindle shaped (SS) and round shaped (RS). A detailed analysis of these two populations showed that SS, AF, MSCs expressed CD90 antigen in a higher level and exhibited a greater proliferation potential. To characterize better these two populations we generated a comparative proteomic map of SS, AF, MSCs and RS, AF, MSCs identifying 25 differentially expressed proteins. Furthermore SS, AF, MSCs exhibited significantly higher migration ability on extracellular matrices in vitro and thus we further evaluated SS, AF, MSCs for potential use as therapeutic tools in vivo GFP lentiviral transduced SS, AF, MSCs were then successfully delivered into immunosuppressed mice distributed in different tissues and survived longterm in vivo. For this reason we next investigated the possible use of SS, AF, MSCs as an efficient tool for the treatment of bladder cancer. Mesenchymal stem cells are an advantageous cell type for such therapeutic schemes as they exhibit an innate tropism to solid tumors in vivo. We next investigated the SS AF MSCs tropism and capability to transport interferon β (IFNβ) to the region of neoplasia in a bladder tumor model. To this end we used the T24M bladder cancer cell line previously generated from our studies and developed a disease progression model in immunosuppressed mice that can recapitulate the molecular events of bladder carcinogenesis. Our results documented that SS, AF, MSCs exhibited high motility when migrated either to T24M cells. Furthermore, SS, AF, MSCs expressing either GFP or IFNβ were administered intravenously to T24M tumor bearing animals to examine their therapeutic effect GFP and IFNβ, AF, MSCs successfully migrated and colonized at the tumor site. Notably a significant inhibition of tumor growth as well as a prolonged survival of mice was observed in the presence of IFNβ, SS, AF, MSCs. Collectively these results document the great potential of AF MSCs as anti cancer vehicles implemented by the targeting of the tumor site and further facilitated by their high proliferation rate and expansion efficiency in culture.

Τα ανθρώπινα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα (MSCs) αποτελούν μια σημαντική πηγή πολυδυνάμων κυττάρων για την συστηματική εφαρμογή αυτόλογης κυτταρικής και γονιδιακής θεραπείας. Μια εναλλακτική πηγή χωρίς την παρουσία ηθικών ζητημάτων είναι το αμνιακό υγρό (AF). Στην παρούσα διδακτορική διατριβή πραγματοποιήθηκε απομόνωση και καλλιέργεια εμβρυϊκών MSCs από αμνιακό υγρό δευτέρου τρίμηνου από προγραμματισμένες αμνιοκεντήσεις. Τα AF MSCs χαρακτηρίστηκαν φαινοτυπικά και δείχθηκε ότι ήταν θετικά για όλους τους μεσεγχυματικούς δείκτες. Ακολούθησε ο εντοπισμός δυο μορφολογικά διακριτών υποπληθυσμών κυττάρων στις αρχικές αποικίες των AF MSCs σχήματος ατρακτοειδούς [spindle shaped (SS)] ή σφαιρικού [round shaped (RS)] οι οποίοι ονομάστηκαν SS, AF, MSCS και RS, AF, MSCs αντιστοίχως. Λεπτομερής ανάλυση των δύο αυτών υποπληθυσμών κατόπιν μηχανικού διαχωρισμού έδειξε ότι τα SS, AF, MSCs παρουσιάζουν υψηλότερο ρυθμό πολλαπλασιασμού και χαρακτηρίζονται από σημαντικά αυξημένη μεταναστευτική ικανότητα in vitro προς εξωκυττάριες ουσίες σε σχέση με τα RS, AF, MSCs. Ακολούθησε η εκτίμηση της χρήσης των SS, AF, MSCs ως εργαλείων σε in vivo θεραπευτικές προσπελάσεις. Αρχικά πραγματοποιήθηκε διαμόλυνση των SS, AF, MSCs με λεντιικό φορέα που φέρει το γονίδιο GFP. Ακολούθησε ενδοφλέβια χορήγηση των κυττάρων αυτών σε ανοσοκατεσταλμένα NOD/SCID ποντίκια και διαπιστώθηκε η επιβίωση τους in vivo σε διάφορους ιστούς για μεγάλο χρονικό διάστημα. Στη συνέχεια ακολούθησε η αξιοποίηση των SS, AF, MSCs σε in vivo θεραπευτικές προσπελάσεις και συγκεκριμένα στην ιστοειδική μεταφορά ογκοκατασταλτικών ουσιών στην περιοχή νεοπλασιών. Τα μεσεχγυματικά βλαστικά κύτταρα παρουσιάζουν έναν έμφυτο τροπισμό προς συμπαγείς όγκους in vivo. Έτσι αρχικά διερευνήθηκε η ικανότητα μετανάστευσης των SS, AF, MSCs προς περιοχές νεοπλασίας ενός πειραματικού μοντέλου καρκίνου της ουροδόχου κύστεως με τη χρήση της Τ24Μ κυτταρικής σειράς. Ακολούθησαν in vivo μελέτες όπου SS, AF, MSCs διαμολυσμένα με κατάλληλο λεντιιό που επάγει την έκφραση της ογκοκατασταλτικής πρωτεΐνης IFNβ χορηγήθηκαν στα παραπάνω ζωικά μοντέλα. Έτσι διαπιστώθηκε ο τροπισμός των AF, MSCs προς την περιοχή του όγκου καθώς και η σημαντική υποστροφή του μεγέθους του όγκου και η αυξημένη διάρκεια ζωής των ζώων παρουσία των IFNβ SS, AF, MSCs. Συνολικά τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ότι τα AF, MSCs μπορούν μελλοντικά να αξιοποιηθούν σε νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις για την ιστοειδική μεταφορά ογκοκατασταλτικών ουσιών και την αποτελεσματική θεραπεία νεοπλασιών.