Απομόνωση και χαρακτηρισμός μεσεγχυματικών κυττάρων από μυελό των οστών παιδιών με οξεία λευχαιμία

Abstract

Introduction Mesenchymal stromal cells (MSCs) are important component of the bone marrow microenvironment which regulates the survival, proliferation and differentiation of hematopoietic stem cells, while their characterization is not complete. Considering the participation of marrow microenvironment in the development and progress of leukemia, one could apply the hypothesis that MSCs are involved in abnormal hematopoiesis. MSCs involvement in acute lymphoblastic leukemia in children has recently been addressed and there are indications that the proliferation rate is slower and the support of hematopoiesis in long term cultures is affected. The aim of this study is the morphological, immunophenotypical and functional characterization of mesenchymal stromal cells from the bone marrow of children with acute lymphoblastic leukemia in the diagnosis of disease, in order to assess the possible effect of leukemia in biological and functional characteristics. There will further be compared with the relevant characteristics of MSC derived from different treatment phases, in order to evaluate the effect of treatment on these features.Methodology The samples of the study include bone marrow (BM) from children with acute lymphoblastic leukemia (ALL) at diagnosis, at the different phases of the treatment during the therapeutic protocol and at the end of chemotherapy after treatment completion. The control group consisted of BM samples from children with solid tumors without BM involvement. The proliferation capacity of pluripotent mesenchymal cells was studied by cell doubling time (DT) calculation at all stages, after each trypsinization. The clonogenicity was evaluated by colony forming unit- fibroblast (CFU-F) formation. For the immunophenotypic profile the expression of surface antigens, relevant for mesenchymal and hematopoietic cells in various stages of culture was performed by flow cytometry. Apoptosis and cell cycle analysis were assessed at passages P2 and P4 with flow cytometry. The ability of mesenchymal stromal cells to differentiate into adipocytes, chondrocytes and osteocytes was studied in passages P2 or P3 of cultures. Differentiation was confirmed by histochemical analysis after staining with Oil Red O for adipocytes, von Kossa for osteocytes and Alcian Blue for chondrocytes. SDF-1a and angiopoietin-1 levels in MSC supernatant at diagnosis and in different phases of treatment were assessed by ELISA. For some of the above features the results were reviewed after classification of the patients into medium-risk group (MR) and high-risk group (HR), according to the prognostic factors for ALL outcome. The results of the experiments are expressed as mean ± standard error of the mean (SEM) unless otherwise indicated. Differences between groups were assessed using the non-parametric Mann–Whitney U-test. p-values lower than 0.05 were considered as statistically significant. For the statistical analysis the statistical package SPSS, (v18.0) was used.ResultsMorphology: BM MSCs from all groups were expanded up to the fifth passage and all displayed the characteristic spindle-shape morphology. No morphological differences were observed among cells of different groups.Immunophenotypic analysis: The immunophenotypic analysis was performed in mononuclear cells (D0) and in mesenchymal cells at passages P2 and P4. There were no differences in the expression of surface antigens among groups. At diagnosis, mesenchymal cells highly express the CD90, CD105, CD146, CD29, CD44, CD95 and CD73 markers, while there was no expression of the hematopoietic markers CD34, CD45 and CD14. The same profile remained in all phases of treatment, at the end of chemotherapy and in the control group. Growth rate (DT ): Mesenchymal cells in the fraction of mononuclear cells (D0) required several days at diagnosis to form layer. In the next passages, cell doubling time was similar in all groups (diagnosis, day 15 and 33 of therapy, consolidation therapy, maintenance and at the end of treatment). These results indicate that mesenchymal cells present in the fraction of mononuclear cells at diagnosis which, is mainly constituted of lymphoblasts, expanded more slowly compared to treatment phases and the control group, but this defect subsides with the progression of culture (more advanced P). It was found that the more advanced the passage was, the slower was the proliferation rate in all groups and there were no differences between the phases of treatment and the control group. The HR group numerically presented lower doubling time at diagnosis at the beginning of the culture and at the initial passages (P1 to P2) but the comparison of the DT between High (HR) and Medium (MR) risk patients, in each treatment group showed no statistically significant difference.CFU - F development: On day 0, the CFU-F formation at the time of diagnosis was impaired compared to the treatment phases, the end of chemotherapy and the control group. The number of CFU-F gradually increases from d15, but continues to lag behind until d33 compared with the other phases of treatment. This result derives from the lesser number of medium and large-sized colonies that grow. In the initial stages of culture there are more large-sized colonies, while in advanced stages of the population of CFU-F colonies consist, mainly, of small-sized colonies. The reduced CFU-F development at diagnosis was a constant finding observed at subsequent passages as well. With the progress of cultures, the number of colonies formed appears reduced at all treatment phases and at the control group and became statistically significant at the later passages (P1 vs P4 or P5). Comparing clonogenicity of the risk groups there was no statistically significant difference in the total number of CFU-F although in most cases MR were producing more colonies than HR.. MSC n the fraction of mononuclear cells (MNCs) in both risk groups developed fewer colonies atdiagnosis compared to other phases, finding that should be attributed to large-size colonies. Differentiation capacity: The ex vivo expanded mesenchymal cells differentiated successfully into the three cell types namely adipocytes (A), osteocytes (O), chondrocytes (C). At diagnosis the differantiation capacity was defective in comparison with the treatment phases of leukemia. Study and analysis of cell cycle: Cell cycle was studied at P2 and P4 by flow cytometry and, according to the results, the higher percentage of mesenchymal cells were found in the quiescence phase.Study and analysis of apoptosis: The study of apoptosis by flow cytometry was performed after staining with 7-AAD, at either P2 or P4. . According to our results, most of the MSC from childhood ALL are in quiescence. This finding confirms the stability of bone marrow MSCs under long-term culture expansion, both at the diagnosis of leukemia and the chemotherapy phases.SDF -1a and Angio -1 expression: SDF-1a in the MSC supernatants at diagnosis was variably expressed and did not differ compared to the treatment phases, and exhibited a more uniform expression in the rest treatment phases. Its levels were higher in the high-risk (HR) group compared to the medium-risk (MR) group. As far as Ang-1 expression is concerned, in the two cell subpopulations of MNCs and MSCs, and the different treatment groups our results showed that, similar to SDF-1a, stromal cells secreted statistically significant higher amounts of this growth factor. No difference was found in the comparison of diagnosis with treatment groups. The Ang-1 levels of the MSC population were independent of the risk group as no difference was observed between HR and MR patients. Discussion Mesenchymal stromal cells support and regulate hematopoiesis, constituting a major component of the bone marrow microenvironment, although they represent only a small proportion of nucleated cells. The structure that represents the hematopoietic niche has a key role in the functional maintenance of hematopoietic stem cells by protecting them from harmful external factors. Maintaining homeostasis of the hematopoietic system requires a balance between self renewal, differentiation and apoptosis of hematopoietic cells and interaction with the bone marrow microenvironment. MSCs participate in the organization of the haematopoietic niche, exercising a key role in homing, mobilization and expansion of HSCs. Their presence is necessary for the installation and maintenance of HSCs and, moreover, they regulate the normal function of hematopoietic cells and maintain homeostasis in the niche, via secretion of growth factors. There are indications that haematological malignancies are associated with deregulation in the microenvironment of the bone marrow and that MSCs participate in the process of developing neoplasia by modifying the phenotype of tumours of the hematopoietic system. Acute lymphoblastic leukemia is a heterogeneous disease of the hematopoietic tissue, as a result of accumulation of mutations and abnormal proliferation of progenitor B lymphocytes. It is the most common malignancy in children. The potential role or contribution of MSCs in the disease onset and the subsequent course of it and in the response to treatment is not yet studied. Also, there has been shown that mesenchymal bone marrow cells of children are not similar to those of adults. The data obtained for the proliferation capacity, the clonogenicity and the trilineage differentiation ability of mesenchymal cells, suggest that the presence of blasts in the diagnosis of acute lymphoblastic leukemia affects these characteristics, while the application of chemotherapeutic agents during treatment has no effect. The last decade the hypothesis that disturbances in the cell cycle regulation and the sequence of events of apoptosis lead to genetic instability, resulting in predisposition to malignant transformation, is gaining interest. In particular, there is the possibility of the involvement of deregulation between self renewal of blood cells and their ability to lead to apoptosis in pathogenesis, but also in the development of leukemia. Our results confirm the stability of bone marrow MSCs in long-term culture conditions, both in the diagnosis of leukemia and in treatment phases. Finally, we evaluated the levels of SDF-1a and Ang-1, recently revealed as major regulators in the crosstalk between hematopoietic progenitors and their microenvironment. Data reporting the expression of SDF-1a by BM MSCs in patients with hematological malignancies are limited. SDF-1a in the supernatant of MSCs at diagnosis of ALL was slightly increased compared to that from treatment phases, although this difference was not statistically verified. Interestingly, high-risk patients exhibited higher levels compared to the medium-risk ones, a difference no longer occurring upon treatment initiation. We found that the lowest amount of Ang-1 was expressed in MSC culture supernatant from diagnosis, albeit not statistically differently from treatment phases. In conclusion, biological characteristics and functional properties of MSCs are affected at the onset of leukemia. Most defects persist throughout passages. MSCs recover after treatment initiation and remission achievement and are not affected by chemotherapy. Their secretory profile remains unaltered by the disease. The summing of these data clearly indicates that any effect on MSCs from the leukemic clones in childhood ALL is transient and ceases upon treatment initiation.

Εισαγωγή Τα μεσεγχυματικά κύτταρα στρώματος (ΜΚ) αποτελούν σημαντικό συστατικό του μυελικού μικροπεριβάλλοντος, το οποίο ρυθμίζει την επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων, ενώ πλήρης χαρακτηρισμός τους δεν έχει επιτευχθεί. Δεδομένης της θεωρίας συμμετοχής του μικροπεριβάλλοντος του μυελού στην λευχαιμική εκτροπή, θα μπορούσε να ισχύσει η υπόθεση ότι και τα ΜΚ εμπλέκονται στη διαταραχή της φυσιολογικής αιμοποίησης. Η συμμετοχή των ΜΚ στην οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία στα παιδιά έχει πρόσφατα προταθεί και υπάρχουν ενδείξεις ότι ο ρυθμός πολλαπλασιασμού τους είναι επιβραδυμένος και η ικανότητα υποστήριξης της αιμοποίησης σε μακροχρόνιες καλλιέργειες είναι επηρεασμένη. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι ο μορφολογικός, ανοσοφαινοτυπικός και λειτουργικός χαρακτηρισμός των μεσεγχυματικών κυττάρων στρώματος από μυελό των οστών παιδιών με οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία στη διάγνωση της νόσου, ώστε να εκτιμηθεί η πιθανή επίδραση της λευχαιμίας στα βιολογικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά τους. Επίσης, θα γίνει σύγκριση των χαρακτηριστικών τους στις φάσεις θεραπείας και στο τέλος αυτής, προκειμένου να εκτιμηθεί η επίδραση της χημειοθεραπείας στα ΜΚ.Μεθοδολογία Το υλικό της μελέτης περιλαμβάνει δείγματα μυελού των οστών (ΜΟ) από παιδιά με οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία (ΟΛΛ) στη διάγνωση, σε διάφορες φάσεις υπό θεραπεία και στο τέλος, μετά την ολοκλήρωση της. Μελετήθηκε η ικανότητα πολλαπλασιασμού των πολυδύναμων μεσεγχυματικών κυττάρων με υπολογισμό του χρόνου κυτταρικού διπλασιασμού (DT) σε όλα τα στάδια επανακαλλιέργειας, μετά από κάθε θρυψινοποίηση. Η κλωνογονικότητα των πολυδύναμων μεσεγχυματικών κυττάρων μελετήθηκε με την ικανότητα σχηματισμού αποικιών ινοβλαστών (CFU-F). Για την ανοσοφαινοτυπική ανάλυση των δειγμάτων προσδιορίστηκεη έκφραση συγκεκριμένων αντιγόνων επιφανείας, χαρακτηριστικών των μεσεγχυματικών και αιμοποιητικών κυττάρων, σε διάφορα στάδια καλλιέργειας. Η εκτίμηση της απόπτωσης και η μελέτη του κυτταρικού κύκλου έγιναν στις επανακαλιέργειες P2 και P4 με κυτταρομετρία ροής. Η ικανότητα των πολυδύναμων μεσεγχυματικών κυττάρων να διαφοροποιούνται προς λιποκύτταρα, οστεοκύτταρα και χονδροκύτταρα μελετήθηκε στα στάδια P2 ή P3 των καλλιεργειών. Η ιστοχημική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με χρώση Oil Red O για τα λιποκύτταρα, von Kossa για τα οστεοκύτταρα και Alcian Blue για τα χονδροκύτταρα. Ο ποσοτικός προσδιορισμός των παραγόντων SDF-1a και Angio-1 έγινεμε τη μέθοδοELISA στο υπερκείμενο των καλλιεργειών των πειραμάτων. Για ορισμένα από τα παραπάνω χαρακτηριστικά έγινε αξιολόγηση και μετά από κατηγοριοποίηση σε ομάδα ενδιάμεσου κινδύνου (MR) και σε ομάδα υψηλού κινδύνου (HR), με βάση τους προγνωστικούς παράγοντες της ΟΛΛ σύμφωνα με το πρωτοκόλλο θεραπείας. Τα αποτελέσματα όλων των πειραμάτων εκφράζονται ως μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής (mean± standard error of the mean, SEM). Για τη στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων χρησιμοποιήθηκε το Στατιστικό πακέτο για εφαρμογή στις Κοινωνικές Επιστήμες (SPSS, v18.0).ΑποτελέσματαΜορφολογία: Τα μεσεγχυματικά κύτταρα του μυελού των οστών εμφάνισαν στην πρώτη καλλιέργεια και διατήρησαν στις επόμενες το χαρακτηριστικό ατρακτοειδές σχήμα, χωρίς μορφολογικές διαφορές μεταξύ των κυττάρων των διαφορετικών ομάδων.Ανοσοφαινοτυπική ανάλυση: Η ανοσοφαινοτυπική ανάλυση πραγματοποιήθηκε στα μονοπύρηνα κύτταρα (D0) και στα μεσεγχυματικά κύτταρα των σταδίων P2 και P4. Δεν υπήρξαν διαφορές στην έκφραση των μονοκλωνικών αντισωμάτων μεταξύ των ομάδων. Στη διάγνωση, τα μεσεγχυματικά κύτταρα εκφράζουν σε πολύ υψηλό ποσοστό τους δείκτες CD90, CD105, CD146, CD29, CD44, CD95 και CD73, ενώ η έκφραση των αιμοποιητικών δεικτών CD34, CD45 και CD14 είναι μηδενική. Το ίδιο ανοσοφαινοτυπικό προφίλ παρέμεινε σε όλες τις φάσεις της θεραπείας, στο τέλος της χημειοθεραπείας και στην ομάδα ελέγχου. Διαφοροποίηση: Τα ex vivo εκπυγμένα μεσεγχυματικά κύτταρα διαφοροποιήθηκαν επιτυχώς προς τους τρεις κυτταρικούς τύπους λιποκύτταρα (A), οστεοκύτταρα (O), χονδροκύτταρα (C). Στη διάγνωση η διαφοροποίηση και προς τις τρεις σειρές ήταν φτωχότερη σε σύγκριση με τις φάσεις θεραπείας της λευχαιμίας, όπου παρατηρήθηκε ίδια ικανότητα διαφοροποίησης με την ομάδα ελέγχου. Χρόνος κυτταρικού διπλασιασμού (DT): Τα μεσεγχυματικά κύτταρα στο κλάσμα των μονοπύρηνων κυττάρων (D0) χρειάστηκαν περισσότερες ημέρες στη διάγνωση για το σχηματισμό στρώματος. Στις επόμενες επανακαλλιέργειες, ο χρόνος κυτταρικού διπλασιασμού ήταν παρόμοιος σε όλες τις ομάδες των δειγμάτων (διάγνωση λευχαιμίας, ημέρα 15 και 33 εισαγωγής στην ύφεση, εδραίωση της ύφεσης, διατήρηση της ύφεσης και τέλος θεραπείας). Τα αποτελέσματα αυτά, καταδεικνύουν ότι τα μεσεγχυματικά κύτταρα στο κλάσμα των μονοπύρηνων κυττάρων στη διάγνωση, που απαρτίζεται κυρίως από λεμφοβλάστες, παρουσιάζουν βραδύτερο ρυθμό έκπτυξης σε σχέση με τα μεσεγχυματικά κύτταρα στις φάσεις θεραπείας της λευχαιμίας και της ομάδας ελέγχου. Η μειονεκτική αυτή ικανότητα πολλαπλασιασμού αποκαθίσταται γρήγορα, με την πρόοδο των καλλιεργειών. Διαπιστώθηκε ότι, όσο πιο προχωρημένο ήταν το στάδιο επανακαλλιέργειας, τόσο μεγαλύτερος ήταν και ο χρόνος κυτταρικού πολλαπλασιασμού (βραδύτερος ρυθμός πολλαπλασιασμού) σε όλες τις ομάδες δειγμάτων, χωρίς διαφορές μεταξύ των φάσεων της θεραπείας, αλλά και της ομάδας ελέγχου. Σε ό,τι αφορά στη μελέτη μετά από διαχωρισμό σε ομάδα υψηλού κινδύνου (HR) και ενδιάμεσου κινδύνου (MR), παρατηρήθηκε ότι τα μεσεγχυματικά κύτταρα των ασθενών υψηλού κινδύνου είχαν μικρότερο χρόνο κυτταρικού διπλασιασμού στη διάγνωση, στην αρχική καλλιέργεια και στα πρώτα στάδια επανακαλλιέργειας (μέχρι το P2).Σχηματισμός αποικιών CFU-F: Την ημέρα 0, η ικανότητα σχηματισμού αποικιών CFU-F ήταν μειονεκτική στη διάγνωση σε σχέση με τις φάσεις θεραπείας, το τέλος της χημειοθεραπείας και την ομάδα ελέγχου. Ο αριθμός των CFU-F σταδιακά αυξάνεται ήδη από τη d15, αλλά εξακολουθεί να υπολείπεται έως και τη d33 σε σύγκριση με τις υπόλοιπες φάσεις θεραπείας. Το αποτέλεσμα αυτό προκύπτει από το μικρότερο αριθμό αποικιών μεσαίου και μεγάλου μεγέθους που αναπτύσσονται. Στα αρχικά στάδια προεξάρχουν οι αποικίες μεγάλου μεγέθους, ενώ σε προχωρημένα στάδια επανακαλλιέργειας ο πληθυσμός των CFU-F αποικιών απαρτίζεται, κυρίως, από αποικίες μικρού μεγέθους. Η ελαττωμένη κλωνογονικότητα των μεσεγχυματικών κυττάρων στη διάγνωση ήταν σταθερό εύρημα και παρατηρήθηκε σε όλα τα στάδια επανακαλλιέργειας. Με την πρόοδο των καλλιεργειών, ο αριθμός των σχηματιζόμενων αποικιών εμφανίζεται μειωμένος σε όλες τις φάσεις και στα δείγματα της ομάδας ελέγχου, ενώ σε προχωρημένα στάδια επανακαλλιέργειας (P4, P5) προέκυψε στατιστικά σημαντική διαφορά. Στη μελέτη της ομάδας υψηλού κινδύνου σε σχέση με την ομάδα ενδιάμεσου κινδύνου, δε διαπιστώθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στην ικανότητα σχηματισμού αποικιών, παρά το γεγονός ότι στις περισσότερες περιπτώσεις, τα δείγματα ασθενών υψηλού κινδύνου ανέπτυξαν λιγότερες αποικίες από τα δείγματα ασθενών ενδιάμεσου κινδύνου. Η ελαττωμένη κλωνογονικότητα στη διάγνωση παρατηρήθηκε και στην κατάταξη στις ομάδες υψηλού και ενδιάμεσου κινδύνου. Στο κλάσμα των μονοπύρηνων κυττάρων (MNCs) και στις 2 ομάδες κινδύνου παρατηρήθηκε μικρότερος αριθμός αποικιών CFU-F στη διάγνωση συγκριτικά με τις υπόλοιπες φάσεις, εύρημα που φαίνεται ότι οφείλεται στις αποικίες μεγάλου μεγέθους. Μελέτη και ανάλυση κυτταρικού κύκλου: Η μελέτη του κυτταρικού κύκλου πραγματοποιήθηκε με κυτταρομετρία ροής στα στάδια επανακαλλιέργειας P2 και P4 και, σύμφωνα με τα αποτελέσματα της ανάλυσης, το μεγαλύτερο ποσοστό των μεσεγχυματικών κυττάρων βρίσκεται σε φάση ηρεμίας.Μελέτη και ανάλυση απόπτωσης: Η μελέτη της απόπτωσης πραγματοποιήθηκε με κυτταρομετρία ροής μετά από χρώση με 7-AAD, επίσης στα στάδια επανακαλλιέργειας P2 και P4 και επιβεβαίωσε τη σταθερότητα των ΜΚ του μυελού των οστών σε συνθήκες μακροχρόνιας καλλιέργειας, τόσο στη διάγνωση της λευχαιμίας όσο και στις φάσεις χημειοθεραπείας. Παρατηρήθηκε μικρότερο ποσοστό απόπτωσης στις φάσεις και στο τέλος της θεραπείας σε σχέση με τη διάγνωση, με σταθερά όμως και εδώ ποσοστά στις επανακαλλιέργειες P2 και P4. Έκφραση παραγόντων SDF-1a και Angio-1: Η έκφραση του παράγοντα SDF-1a ήταν μεγαλύτερη στα κύτταρα του στρώματος και παρουσίασε μεγάλο εύρος διακύμανσης τιμών στα υπερκείμενα των καλλιεργειών των μεσεγχυματικών κυττάρων στη διάγνωση, ενώ στις φάσεις της θεραπείας η έκφρασή του ήταν πιο ομοιογενής. Στη διάγνωση της λευχαιμίας, διαπιστώθηκε μεγαλύτερο ποσοστό έκφρασης σε σχέση με τις φάσεις χημειοθεραπείας, χωρίς να υπάρξει στατιστικά σημαντική διαφορά. Επίσης, στα δείγματα της διάγνωσης, ήταν μεγαλύτερη η έκφραση του παράγοντα στους ασθενείς υψηλού κινδύνου και μικρότερη στους ασθενείς ενδιάμεσου κινδύνου. Στην ομάδα ελέγχου δε μελετήθηκε η έκφραση του παράγοντα. Η έκφραση του παράγοντα Ang-1 στους υποπληθυσμούς των μονοπύρηνων και των μεσεγχυματικών κυττάρων, ήταν συγκριτικά μεγαλύτερη στα κύτταρα του στρώματος και παρουσίασε στατιστικά σημαντική διαφορά. Δε διαπιστώθηκε διαφορά στα επίπεδα του παράγοντα μεταξύ της διάγνωσης και των φάσεων θεραπείας, ενώ ήταν ανεξάρτητα από το διαχωρισμό σε ομάδα υψηλού και σε ομάδα ενδιάμεσου κινδύνου στη διάγνωση και στις φάσεις χημειοθεραπείας, ενώ στο τέλος της θεραπείας προέκυψε στατιστικά σημαντική διαφορά.Συζήτηση Τα μεσεγχυματικά κύτταρα υποστηρίζουν και ρυθμίζουν την αιμοποίηση, αποτελώντας σημαντικό συστατικό του μικροπεριβάλλοντος του μυελού των οστών, παρά το γεγονός ότι αποτελούν μικρό μόνο ποσοστό των εμπύρηνων κυττάρων. Η δομή που αντιπροσωπεύει την αιμοποιητική φωλεά έχει βασικό ρόλο στη λειτουργική διατήρηση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων και την προστασία τους από εξωγενείς βλαπτικούς παράγοντες. Η διατήρηση της ομοιόστασης του αιμοποιητικού συστήματος προϋποθέτει την ισορροπία μεταξύ αυτοανανέωσης, διαφοροποίησης και απόπτωσης των αιμοποιητικών κυττάρων καθώς και την αδιατάρακτη αλληλεπίδρασή τους με το μικροπεριβάλλον του μυελού των οστών. Τα ΜΚ συμμετέχουν στην οργάνωση της αιμοποιητικής φωλεάς, ασκώντας καθοριστικό ρόλο στη δέσμευση, κινητοποίηση και έξοδο των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων (ΑΑΚ). Η παρουσία τους είναι απαραίτητη για την εγκατάσταση και διατήρηση των ΑΑΚ, ενώ, επιπλέον, ρυθμίζουν τη λειτουργία των αιμοποιητικών κυττάρων και διατηρούν την ομοιόσταση της φωλεάς, μέσω έκκρισης αυξητικών παραγόντων. Υπάρχουν βιβλιογραφικές ενδείξεις ότι οι αιματολογικές κακοήθειες συνδέονται με απορρύθμιση στο μικροπεριβάλλον του μυελού των οστών και ότι τα ΜΚ συμμετέχουν στη διαδικασία ανάπτυξης νεοπλασίας, είτε ενισχύοντας τη δημιουργία είτε τροποποιώντας το φαινότυπο νεοπλασιών του αιμοποιητικού συστήματος. Η οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία αποτελεί αγνώστου αιτιολογίας ετερογενές νόσημα του αιμοποιητικού ιστού, αποτέλεσμα συσσώρευσης μεταλλάξεων και ανώμαλου πολλαπλασιασμού των προγονικών Β λεμφοκυττάρων. Είναι ο συχνότερος κακοήθης όγκος στα παιδιά. Δεν έχει μελετηθεί πιθανός ρόλος ή η συμβολή των ΜΚ στην έναρξη της νόσου και στη μετέπειτα πορεία της καθώς και στην ανταπόκριση στη θεραπεία . Παράλληλα δε, υπάρχει το δεδομένο ότι, τα μεσεγχυματικά κύτταρα μυελού των οστών των παιδιών δεν είναι παρόμοια με τα αντίστοιχα των ενηλίκων. Τα δεδομένα που προέκυψαν για την πολλαπλασιαστική δυνατότητα, την κλωνογονικότητα και την ικανότητα διαφοροποίησης των μεσεγχυματικών κυττάρων, καταδεικνύουν ότι η διήθηση του μυελού των οστών από λεμφοβλάστες στη διάγνωση της οξείας λεμφοβλαστικής λευχαιμίας επηρεάζει αυτά τα χαρακτηριστικά τους, ενώ δεν έχει επίδραση η χορήγηση των χημειοθεραπευτικών παραγόντων κατά τη διάρκεια της θεραπείας. Την τελευταία δεκαετία εγείρεται η υπόθεση ότι διαταραχές στην ρύθμισή του κυτταρικού κύκλου και στην αλληλουχία των γεγονότων της απόπτωσης οδηγούν σε γενετική αστάθεια, με αποτέλεσμα την προδιάθεση σε κακοήθη εξαλλαγή. Ειδικότερα, εκφράζεται η πιθανότητα εμπλοκής της απορρύθμισης μεταξύ πολλαπλασιασμού των κυττάρων του αίματος και της ικανότητάς τους να οδηγηθούν σε απόπτωση στην παθογένεια, αλλά και την εξέλιξη της λευχαιμίας. Τα αποτελέσματά μας επιβεβαιώνουν τη σταθερότητα των ΜΚ του μυελού των οστών σε συνθήκες μακροχρόνιας καλλιέργειας, τόσο στη διάγνωση της λευχαιμίας όσο και στις φάσεις χημειοθεραπείας. Οι παράγοντες αγγειοποιητίνη-1 και SDF-1a έχουν πρόσφατα χαρακτηριστεί ως μείζονες ρυθμιστές της αλληλεπίδρασης μεταξύ προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων και μικροπεριβάλλοντος του μυελού των οστών Η έκφραση του παράγοντα SDF-1a στα υπερκείμενα διαλύματα των καλλιεργειών των μεσεγχυματικών κυττάρων ΜΟ παιδιών με ΟΛΛ βρέθηκε σημαντικά αυξημένη στα δείγματα της διάγνωσης της λευχαιμίας σε σύγκριση με τα δείγματα των φάσεων θεραπείας, χωρίς, όμως, να προκύπτει στατιστικά σημαντική διαφορά. Ενδιαφέρον παρουσιάζει η διαπίστωση της συσχέτισης με τους προγνωστικούς παράγοντες, αφού στην ομάδα των ασθενών υψηλού κινδύνου η ποσοτική έκφραση ήταν μεγαλύτερη σε σχέση με την ομάδα των ασθενών ενδιάμεσου κινδύνου. Η διαφορά αυτή παύει να υφίσταται με την έναρξη της χημειοθεραπείας. Οι χαμηλότερες τιμές αγγειοποιητίνης 1 που παρατηρήθηκαν εκφράζονται στο υπερκείμενο διάλυμα των καλλιεργειών των μεσεγχυματικών κυττάρων στη διάγνωση της λευχαιμίας και, μάλιστα, ανεξαρτήτως της ομάδας κινδύνου. Δεν προέκυψε στατιστικά σημαντική διαφορά μετά τη σύγκριση με τις φάσεις χημειοθεραπείας. Συμπερασματικά, τα βιολογικά χαρακτηριστικά και οι λειτουργικές ιδιότητες των μεσεγχυματικών κυττάρων που μελετήθηκαν επηρεάζονται από τη διήθηση του μυελού των οστών στη διάγνωση της οξείας λεμφοβλαστικής λευχαιμίας, ενώ οι μεταβολές παραμένουν και στις επανακαλλιέργειες. Αντίθετα, τα μεσεγχυματικά κύτταρα αναλαμβάνουν λειτουργικά με την έναρξη της χημειοθεραπείας και την επίτευξη της ύφεσης της νόσου και δεν επηρεάζονται από τη θεραπεία. Η ικανότητα έκκρισης αυξητικών παραγόντων (αγγειοποιητίνη-1) και χημειοκινών (παράγοντας SDF-1a) δεν επηρεάζεται από τη λευχαιμία. Τα αποτελέσματα δεν μπορούν να αποσαφηνίσουν το ρόλο των μεσεγχυματικών κυττάρων στη λευχαιμογένεση και να απαντήσουν στο ερώτημα αν τα λευχαιμικά κύτταρα προστατεύονται ή εκτίθενται στους χημειοθεραπευτικούς παράγοντες από τα μεσεγχυματικά κύτταρα. Δείχνουν, όμως, σαφώς ότι η οποιαδήποτε επίδραση του λευχαιμικού κλώνου στα βιολογικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά των μεσεγχυματικών κυττάρων είναι παροδική και παύει να υφίσταται με την έναρξη της θεραπείας.