Μελέτη του ρόλου των αναδιοργανωτών της χρωματίνης στην αποπτωτική απόκριση των κυττάρων

Abstract

Multiple cellular processes, including gene silencing, cell growth, DNA repair and apoptosis are regulated by the dynamic structure of chromatin. In this study we investigated the role of two histone chaperones, prothymosin α and SET/TAF-I β, which have been implicated in diverse processes, such as chromatin remodeling and cell death, in the regulation of the mitochondrial apoptotic pathway. Our data showed that the expression pattern of prothymosin α is altered during apoptosis induced upon treatment of cancer cells with chemotherapeutic drugs and an apoptotic form of ProTα is generated by proteolytic cleavage by caspase-3. Confocal microscopy experiments showed that the apoptotic ProTα is translocated from the nucleus to the cytoplasm and the cell periphery upon induction of apoptosis. Overexpression of prothymosin α in HeLa cells confers resistance towards apoptosis induced upon cisplatin and etoposide treatment. In accordance to these findings, silencing of prothymosin α sensitizes cells to apoptosis. Our data support the notion that prothymosin α exerts an anti-apoptotic role in cancer cells treated with chemotherapeutic drugs. On the contrary, changes of SET/ΤAF-1β expression levels do not affect the apoptotic response of the cells. Chromatin remodeling complexes have essential roles in many aspects of T-cell development. Furthermore, the generation of a functional T cell’s repertoire is tightly regulated by the apoptotic machinery at different stages and levels. To investigate the role of prothymosin α, through its anti-apoptotic function, in T-cell development, we cultured mouse hematopoietic stem cells (HSCs) in vitro on OP9 mouse stromal cells expressing the Notch-1 ligand Delta-like-1 (OP9-DL1). These HSCs were infected with retroviruses expressing wild type prothymosin α, the constitutively active apoptotic mutant of prothymosin α and a dominant negative prothymosin α mutant, which bears a disrupted caspase-3 recognition site. The differentiation process of the infected T cell precursors through DN, DP and SP developmental stages was followed by multiparameter flow cytometry. Our data showed that T cell maturation was not affected by alterations on the expression levels of the wild type or the mutant forms of prothymosin α. However, our work designates prothymosin α as a putative target molecule for the elaboration of strategies to modulate apoptosis, linked to this protein (inactivation, mutation), that may lead to the conception of new chemotherapeutic approaches

Η αναδιαμόρφωση της δομής της χρωματίνης, καθώς και η τροποποίηση πρωτεϊνών που συμμετέχουν στη διαδικασία αυτή είναι γεγονότα απαραίτητα για τη ρυθμιση και την εκτέλεση του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου. Τα τελευταία χρόνια πολλές μελέτες έχουν αναδείξει πυρηνικές πρωτεΐνες που συμμετέχουν σε μηχανισμούς αναδιαμόρφωσης της δομής της χρωματίνης σε νέους ρυθμιστές της αποπτωτικής διαδικασίας. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε ο ρόλος δύο πρωτεϊνών-αναδιοργανωτών της χρωματίνης, της προθυμοσίνης α και της SET/TAF-1β, στην αποπτωτική απόκριση των κυττάρων, μέσω του ενδογενούς μονοπατιού των μιτοχονδρίων. Η πειραματική προσέγγιση που χρησιμοποιήθηκε ήταν α) η μελέτη των προτύπων έκφρασης της προθυμοσίνης α και της SET/TAF-1β σε φυσιολογικά και αποπτωτικά κύτταρα και β) ο έλεγχος της αποπτωτικής απόκρισης των κυττάρων μετά από υπερέκφραση ή αποσιώπησή τους. Σε αποπτωτικά κύτταρα ανιχνεύθηκε η αποπτωτική μορφή της προθυμοσίνης α, η οποία προκύπτει μετά από την πρωτεόλυσή της προθυμοσίνης α από την κασπάση-3. Η μορφή αυτή ανιχνεύθηκε στο κυτταρόπλασμα και στην περιφέρεια των αποπτωτικών κυττάρων, σε αντίθεση με την ολόκληρου μήκους μορφή της πρωτεΐνης, που εντοπίζεται αποκλειστικά στον πυρήνα. Η υπερέκφραση της προθυμοσίνης α σε φυσιολογικά και αποπτωτικά κύτταρα είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση των επιπέδων της απόπτωσης, ενώ η αποσιώπησή της οδήγησε σε αύξηση των αποπτωτικών πληθυσμών. Σύμφωνα με τα αποτελέσματά μας προθυμοσίνη α επιδεικνύει έναν σαφή προστατευτικό ρόλο έναντι της απόπτωσης που επάγεται μετά από χορήγηση χημειοθεραπευτικών φαρμάκων σε καρκινικά κύτταρα. Αντίθετα, τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν ότι η SET/TAF-1β πιθανώς δεν αποτελεί υπόστρωμα των αποπτωτικών κασπασών και δε συμμετέχει στη ρύθμιση του μονοπατιού αυτού. Ο ρόλος της προθυμοσίνης α, ως αντι-αποπτωτικού μορίου, μελετήθηκε in vitro, στη διαφοροποίηση των Τ λεμφοκυττάρων. H διαδικασία αυτή χαρακτηρίζεται από συνεχείς αλλαγές στη διαμόρφωση της δομής της χρωματίνης και ρυθμίζεται σημαντικά από την απόπτωση. Για το σκοπό της μελέτης αυτής, αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα από το θύμο ποντικιών επιμολύνθηκαν με ρετροϊικούς φορείς έκφρασης τριών μορφών της προθυμοσίνης α : την αγρίου τύπου μορφή, την αποπτωτική μορφή ProT(1-99) και την επικρατή αρνητική της μορφή, η οποία δεν πρωτεολύεται από την κασπάση-3. Μελετήθηκε αναλυτικά η πορεία της διαφοροποίησης των επιμολυσμένων θυμοκυττάρων από το στάδιο DN1 στο στάδιο SP. Η ανάλυση των αποτελεσμάτων του ελέγχου της πορείας της διαφοροποίησης έδειξε ότι η μετάβαση των ανώριμων θυμοκυττάρων από τα αρχικά στα τελικά στάδια της διαδικασίας αυτής δεν επηρεάζεται από αλλαγές των επιπέδων της προθυμοσίνης α ή των μεταλλαγμάτων της. Τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας υποδεικνύουν ότι αλλαγές των επιπέδων της προθυμοσίνης α δεν επηρεάζουν το σύστημα ελέγχου της διαφοροποίησης των Τ λεμφοκυττάρων, το οποίο ειναι αρκετά ευέλικτο, ώστε να μπορεί να ανταποκριθεί σε αλλαγές των επιπέδων μορίων που συμμετέχουν στη ρύθμισή του. Αντίθετα, η εργασία αυτή υποστηρίζει το σημαντικό ρόλο της προθυμοσίνης α στην απόπτωση καρκινικών κυττάρων που επάγεται από χημειοθεραπευτικά φάρμακα, αναδεικνύοντας ένα νέο μόριο-στόχο για τη μελέτη της ανθεκτικότητας των καρκινικών κυττάρων στη χημειοθεραπευτική αγωγή.