Κινητική μελέτη της αλκοολικής ζύμωσης παρουσία νέων βιοκαταλυτών

Abstract

Reversed Flow Gas Chromatography (R.F.G.C.) was used for thedetermination of rate constants for each alcoholic fermentation phase andthe calculation of produced ethanol in the presence of new biocatalysts.The rates for each alcoholic phase were determined in real time from themeasurement of the concentration of produced ethanol. This can be carriedout by developing an appropriate mathematical model for the analysis ofthe experimental data obtained from a versatile gas chromatographictechnique. R.F.G.C is a time-honoured method which involves the change ofthe carrier gas flow direction at various time intervals. It has a vast numberof applications in a wide scientific field such as the determination ofdiffusion and mass transfer coefficients, adsorption equilibrium constantsLenard-Jones parameters, activity coefficients, rate constants, etc.In the present work, the yeast strain used was Saccharomycescerevisiae (ΑΧΑΖ-1), a cryotolerant and alcohol resistant strain, which wasisolated from a Greek vineyard area and is maintained in the collection ofthe Food Technology Laboratory of the Chemistry department at theUniversity of Patras. The immobilization carriers used where differentsources of starch such as raw materials from which starch is derived (wheat,corn and barley grains as well as potato pieces), starch from gel (wheat,corn) and pure starch (wheat, corn).Furthermore, in order to verify the accuracy of the developedmathematical model and of the R.F.G.C. technique to measure ethanolconcentration, the results were compared with those obtained fromconventional Gas Chromatography (G.C.) and distillation as well. Theimmobilization of yeast cells on the above carriers was confirmed byscanning electron microscope. Repeated batch fermentations with glucoseculture medium and must were performed for free and immobilized cellsshowing that biocatalysts lead to shorter fermentation time. From kineticsof the fermentation processes wheat grains seems to be more efficientsupporters than barley, corn, rice grains and potato pieces. Moreover, the corn starch gel prevailing wheat starch gel, as it provides higher rateconstant values as they were determined with R.F.G.C. The kineticparameters confirm the predominance of the biocatalysts against free cellsystems in the fermentation process. The calculated kinetic parameters forthe second phase of the fermentation were one order of magnitude smallerthan those reported for the other two phases. In all cases the same amountsof the produced ethanol were determined at the end of the fermentationeither by measuring it with conventional methods (gas chromatography anddistillation) or with R.F.G.C. This reveals the fact that, R.F.G.C. is atrustworthy method which can be used not only for the determination ofethanol but also for the calculation of rate constants at each alcoholicfermentation phase. In addition to this, the reaction rate constants for eachphase were determined during the alcoholic fermentation processesconducted in a bioreactor of 100 L using as immobilization carrier wheatgrains.Main purpose of this work was also to establish the applicability ofGravitational Field Flow Fractionation (Gr.F.F.F.) technique in order tostudy the affection of environmental conditions, such as external pH andtemperature, on the fermentation kinetics and the proliferation of thealcohol-resistant and psychrophilic Saccharomyces cerevisiae (AXAZ-1) yeaststrain, in the presence or absence of wheat and corn starch granules asimmobilization carrier. Differences in the fractograms monitored byGr.F.F.F., at different values of temperature and pH, make evident thedifferent fermentation kinetic profiles and can be related with the unlikecell growth. Gr.F.F.F. can provide valuable information about yeast cell sizedistribution, density and shape from the determination of retention valuesand the different peak profiles. In addition to this, to confirm thecorrespondence between the fractograms obtained by Gr.F.F.F. with thekinetics of the fermentation processes, analysis of residual sugar (withH.P.L.C.) and ethanol concentration (with G.C.) were performed. Theresults indicate that both systems (free and immobilized cells) performedbetter at 30ºC, whereas at lower temperatures decreases in thefermentation rate and in the number of viable cells were observed. Moreover the pH of the medium (pH=5) resulted in higher fermentationrates and ethanol productivities. The duration and the rate of thefermentation process were shorter in the case of immobilized cells ascompared with free cells, which is in accordance with literature. Moreover,wheat starch granules proved to be a more efficient than corn starchgranules as it provided shorter fermentation times, and higher values ofreaction rate constants and immobilized cells. The activation energy for thefermentation processes was reduced in the case of immobilized cells ascompared with free cells. The above mentioned results confirm thecatalytic activity of both immobilization carriers, with starch granulesprevailing corn grains.The results obtained from the kinetic study of the alcoholicfermentations with the R.F.G.C. and Gr.F.F.F. techniques, led to acomparison between them and confirmed the accuracy and the precision ofthese methods.

Η Αέρια Χρωματογραφία Αναστρεφόμενης Ροής (Α.Χ.Α.Ρ.)χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των σταθερών ταχύτητας σε κάθεφάση της αλκοολικής ζύμωσης καθώς και της παραγόμενης αλκοόλης(αιθανόλης), παρουσία νέων βιοκαταλυτών. Οι σταθερές ταχύτητας σε κάθεφάση της αλκοολικής ζύμωσης προσδιορίστηκαν με την εξαγωγή ενόςμαθηματικού μοντέλου το οποίο συνδέει τα πειραματικά μετρούμενα μεγέθη(ύψος κορυφών έκλουσης) με τη συγκέντρωση της παραγόμενης αιθανόλης.Η τεχνική της Α.Χ.Α.Ρ. στηρίζεται στην απλή ή διπλή αναστροφή της ροήςτου φέροντος αερίου ανά τακτά χρονικά διαστήματα και επιτρέπει τονπροσδιορισμό φυσικοχημικών μεγεθών. Έχει εφαρμοστεί με επιτυχία στονπροσδιορισμό των συντελεστών διάχυσης και μεταφοράς μάζας, τωνσταθερών ισορροπίας προσρόφησης, των παραμέτρων Lennard-Jones,καθώς και στον προσδιορισμό σταθερών ταχύτητας, κ.α.Στην παρούσα διατριβή το είδος της ζύμης που χρησιμοποιήθηκε ήταντο ψυχρόφιλο και αλκοολοανθεκτικό στέλεχος, Saccharomyces cerevisiaeAXAZ-1, το οποίο απομονώθηκε από μια Ελληνική αγροτική περιοχή καιφυλάσσεται στο Εργαστήριο Τεχνολογίας Τροφίμων του Τμήματος Χημείαςτου Πανεπιστημίου Πατρών. @ς φορέας ακινητοποίησης χρησιμοποιήθηκε,για πρώτη φορά το άμυλο σε διαφορετικές μορφές: πρώτες ύλες από τιςοποίες προέρχεται το άμυλο (σιτάρι, κριθάρι, αραβόσιτος, πατάτα, ρύζι),ζελατινοποιημένο άμυλο (σιτάρι, αραβόσιτος), καθώς και καθαρό άμυλο(σιτάρι, αραβόσιτος).Επιπλέον, με σκοπό την πιστοποίηση της ακρίβειας τόσο τουμαθηματικού μοντέλου όσο και της τεχνικής της Α.Χ.Α.Ρ. για τη μέτρηση τηςπαραγόμενης αιθανόλης, πραγματοποιήθηκαν μετρήσεις με δύο επιπλέονμεθόδους: την κλασσική χρωματογραφία και την απόσταξη και έγινεσύγκριση των αποτελεσμάτων. Η ακινητοποίηση των κυττάρων της ζύμηςστους φορείς επιβεβαιώθηκε με φωτογραφίες όπως αυτές ελήφθησαν με τοηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης. Οι επαναλαμβανόμενες αλκοολικέςζυμώσεις, που πραγματοποιήθηκαν σε θρεπτικό γλυκόζης, και εν συνεχεία σε μούστο, απέδειξαν ότι τα ακινητοποιημένα κυτταρικά συστήματαοδήγησαν σε μικρότερους χρόνους ζύμωσης συγκριτικά με τα ελεύθερα.Κατά την κινητική μελέτη των αλκοολικών ζυμώσεων καλύτεροι φορείςακινητοποίησης στην κατηγορία των πρώτων υλών ήταν το σιτάρι, ενώ σεαυτήν του ζελατινοποιημένου αμύλου ο αραβόσιτος, καθώς παρουσίασανυψηλότερες τιμές σταθερών ταχύτητας έναντι των υπολοίπων φορέων, όπωςυπολογίστηκαν με την Α.Χ.Α.Ρ. για κάθε φάση της αλκοολικής ζύμωσης.Αξίζει να σημειωθεί πως οι σταθερές ταχύτητας που υπολογίστηκαν για τηδεύτερη φάση της αλκοολικής ζύμωσης είναι μιας τάξης μεγέθουςμικρότερες σε σχέση με εκείνες που εμφανίζονται στις άλλες δύο φάσεις. Σεόλες τις περιπτώσεις δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στα ποσά τηςπαραγόμενης αιθανόλης που προσδιορίστηκαν στο τέλος των αλκοολικώνζυμώσεων είτε με την Α.Χ.Α.Ρ., είτε με τις μεθόδους της κλασσικήςχρωματογραφίας και της απόσταξης. Από τα παραπάνω συμπεραίνουμε, πωςη Α.Χ.Α.Ρ. παρέχει αξιόπιστα αποτελέσματα συγκριτικά με τις άλλες δύομεθόδους και επιτρέπει τον ταυτόχρονο προσδιορισμό των σταθερώνταχύτητας σε κάθε φάση της αλκοολικής ζύμωσης καθώς και τηςπαραγόμενης αιθανόλης. Επιπλέον, προσδιορίστηκαν οι σταθερές ταχύτηταςγια κάθε φάση των αλκοολικών ζυμώσεων που πραγματοποιήθηκαν σεβιοαντιδραστήρα 100 L χρησιμοποιώντας τον βέλτιστο βιοκαταλύτη(σταθερότητα δραστικότητας του βιοκαταλύτη, σταθερές ταχύτητας για κάθεφάση της ζύμωσης) από την κατηγορία των πρώτων υλών, το σιτάρι.Ένας από τους κύριους σκοπούς της παρούσας διατριβής ήταν ημελέτη της κινητικής των αλκοολικών ζυμώσεων των ελεύθερων καιακινητοποιημένων κυττάρων ΑΧΑΖ-1 σε καθαρό άμυλο (σιτάρι, αραβόσιτος),σε διαφορετικές τιμές θερμοκρασίας και pH, μέσω της ΜονοφασικήςΧρωματογραφίας Βαρυτικού Πεδίου (Μ.Χ.Β.Π.) και η σύγκριση τωναποτελεσμάτων με τα αντίστοιχα που ελήφθησαν με την Α.Χ.Α.Ρ. Η μέθοδοςαυτή (Μ.Χ.Β.Π.) είναι κατάλληλη για τoν χαρακτηρισμό των κυττάρων τωνζυμών και τη μελέτη της βιωσιμότητας και της δραστικότητάς τους.Iιαφορές που εμφανίζονται στις καμπύλες έκλουσης σχετίζονται άμεσα μετις διαφορετικές κατανομές των κυττάρων της ζύμης, τις διαφορετικέςπυκνότητες, τη μορφολογία και/ή το μέγεθός τους. Η Μ.Χ.Β.Π. μπορεί να μας δώσει πολύτιμες πληροφορίες για την κατανομή του μεγέθους τωνκυττάρων της ζύμης, την πυκνότητα και το μέγεθός τους. Για νααποδείξουμε τη σχέση μεταξύ των μεταβολών που παρατηρούνται στιςκορυφές έκλουσης με την κινητική των αλκοολικών ζυμώσεων,πραγματοποιήθηκαν επιπλέον αναλύσεις για τον υπολογισμό της τελικήςσυγκέντρωσης σακχάρου με Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης(H.P.L.C.) καθώς και της % v/v συγκέντρωσης της αιθανόλης με κλασσικήΑέρια Χρωματογραφία (G.C.). Τόσο τα ακινητοποιημένα όσο και ταελεύθερα συστήματα λειτούργησαν καλύτερα στη θερμοκρασία των 30ºCπαρουσιάζοντας τις υψηλότερες τιμές σταθερών ταχύτητας. Η μείωση τηςθερμοκρασίας οδήγησε σε μείωση των σταθερών ταχύτητας της ζύμωσηςκαθώς και του αριθμού των ακινητοποιημένων κυττάρων. Επιπλέον, στο pHτου θρεπτικού υγρού (pH=5), παρατηρήθηκαν υψηλότερες ταχύτητεςζύμωσης καθώς και μεγαλύτερα ποσοστά παραγωγής αιθανόλης. Η διάρκειατων αλκοολικών ζυμώσεων καθώς και οι σταθερές ταχύτητας αυτώνπαρουσίασαν μικρότερες τιμές στα ακινητοποιημένα κύτταρα, συγκριτικά μετα ελεύθερα, γεγονός που συμφωνεί με τη βιβλιογραφία. Τέλος,συγκρίνοντας τα συστήματα των ακινητοποιημένων κυττάρων καλύτεροιχρόνοι ζύμωσης και υψηλότερες τιμές σταθερών ταχύτητας, παρατηρήθηκανόταν σαν φορέας χρησιμοποιήθηκε άμυλο από σιτάρι. Επιπλέον,διαπιστώνουμε πως οι ενέργειες ενεργοποίησης των αλκοολικών ζυμώσεωνεμφανίζουν μικρότερες τιμές παρουσία των φορέων ακινητοποίησης σε κάθετιμή pH. Τα ανωτέρω επιβεβαιώνουν την καταλυτική ικανότητα και των δύοφορέων ακινητοποίησης με το σιτάρι να πλεονεκτεί έναντι του αραβόσιτου.Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν από την κινητική μελέτη τωναλκοολικών ζυμώσεων με τις τεχνικές της Α.Χ.Α.Ρ. και της Μ.Χ.Β.Π.οδήγησαν σε σύγκριση των δύο μεθόδων και επιβεβαίωση της ακρίβειας καιαξιοπιστίας τους.