Μελέτη των υποδοχέων διαφόρων ορμονών του υποθαλάμου σε καρκινοπαθείς

Abstract

Introduction: The hypophysiotropic hormones, CRH and GHRH, secreted by the hypothalamus, reach, via the portal circulation, to the cells of the anterior pituitary. Additionally, some forms of cancer were associated with ectopic secretion of these hormones.Purpose: The purpose of this study was to detect the expression of CRH and GHRH receptors in breast cancer using immunohistochemistry and RT-PCR, to quantify the levels of gene expression using real time RT-PCR and to correlate the results with the histo/clinicopathological characteristics of the patients, their clinical course and their survival.Material: Thirty-three women (aged=60.2±13.2 years, ΒΜΙ=28.2±4.6 kg/m2) with breast cancer who underwent mastectomy in Theagenio Cancer Hospital were included in the study. The maximum diameter of the tumor was> 2 cm in 61% of the patients and <2 cm in the remaining 39%. Distant metastases at the time of diagnosis were found in 6.1% of the patients, whereas 60.6% of the rest of the patients showed lymph node metastases. During follow-up, which lasted from 24 to 68 months, the percentage of recurrent disease was 12.5%. At the end of the study, 81% of patients were free of disease, 13% were still ill and 6% were dead. Two biopsies were taken from each patient, one from the cancerous tissue and another one from the adjacent normal tissue. The results were compared.Method: Gene expression levels were evaluated by real-time PCR following reverse transcription of total RNA extracts. Histological mapping of receptor expression was done by immunohistochemistry, using receptor type selective antisera. Results: The receptors CRH-R1, CRH-R2a, SV1 and pGHRH-R were detected in 16.7%, 33.3%, 37% and 50%, respectively, of malignant biopsies and in 21.7%, 20.8%, 29.6% and 53.8%, respectively, of the biopsies of adjacent normal tissues. Statistical analysis revealed no significant differences. No CRH-R2b transcript was found. Transcript levels of CRH-R1, CRH-R2a, SV1 and pGHRH-R were 0,001023 ± 0,001604, 0,36806255 ± 0,770218392, 1,415537 ± 2,032818 and 4,189554 ± 10, 4429, respectively, in malignant biopsies and 0,000226 ± 0,000376, 0,066274 ± 0,110313, 0,736 ± 1,012704 and 10,12868 ± 19,53721, respectively, in the biopsies of adjacent normal tissues. Statistical analysis revealed no significant differences. Also, there was no significant difference between the expression of CRH-R1 and CRH-R2a, and between the SV1 and pGHRH in malignant tissues. Immunohistochemistry revealed that the two CRH receptor proteins presented distinct distributions, being expressed by other cellular types within the breast tumor. Correlation analysis between the receptors expression and the transcript levels with demographic and clinical characteristics of patients and with the histopathological characteristics of the tumors, showed a negative correlation between the transcript levels of CRH-R1 and the number of full-term pregnancies and between the expression of CRH-R2a and the age of menopause, and a positive correlation between the transcript levels of CRH-R2a and the age of menarche and between the transcript levels of SV1 and the height. Moreover, it was found that the transcript levels of CRH-R1 was negatively related to the expression of pGHRH-R, while the transcript levels of CRH-R2a was positively correlated with the transcript levels of the SV1. Statistical analysis between the expression of the receptors and the time of recurrence of the disease or the survival of the patients revealed no significant differences. Conclusion: All the receptors were found in breast cancer and the respective benign adjacent tissue at similar gene transcript levels. Receptors expression did not correlate to any of the characteristics of the tumor or the patient, indicating no diagnostic potential. Further studies are required in order to unfold biological effects mediated by CRH and GHRH receptors in breast cancer and their potential as therapeutic targets.

Εισαγωγή: Οι υποφυσιοτρόπες ορμόνες, CRH και GHRH, εκκρίνονται από τον υποθάλαμο και, μέσω της πυλαίας κυκλοφορίας, έρχονται σε επαφή με τα κύτταρα του προσθίου λοβού της υπόφυσης. Ωστόσο, συχνά σε καρκίνους, παρατηρείται έκτοπη έκκριση των ορμονών αυτών. Επιπλέον, οι ορμόνες του υποθαλάμου εμπλέκονται στην παθοφυσιολογία του καρκίνου με αυτοκρινικούς και παρακρινικούς μηχανισμούς.Σκοπός: Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν να ανιχνεύσει την παρουσία υποδοχέων της CRH και της GHRH σε καρκίνο του μαστού, με τη χρήση RT-PCR, να ποσοτικοποιηθούν τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης με rtRT-PCR και να γίνει ιστολογική χαρτογράφηση της πρωτεϊνικής έκφρασης με τη χρήση ανοσοϊστοχημείας. Υλικό: Τριάντα τρεις γυναίκες με πρωτοδιαγνωσθέντα καρκίνο του μαστού, οι οποίες υποβλήθηκαν σε τμηματεκτομή ή ριζική μαστεκτομή στο Θεαγένειο Αντικαρκινικό Νοσοκομείο Θεσσαλονίκης εντάχθηκαν στη μελέτη. Οι ασθενείς είχαν ηλικία 60,2±13,2 έτη και δείκτη μάζας σώματος 28,2±4,6 kg/m2. Η μέγιστη διάμετρος του όγκου ήταν >2 cm στο 61% των ασθενών και <2 cm στο υπόλοιπο 39%. Απομακρυσμένες μεταστάσεις κατά τη στιγμή της διάγνωσης βρέθηκαν στο 6,1% των ασθενών. Από τις υπόλοιπες ασθενείς, το 60,6% εμφάνιζε λεμφαδενικές μεταστάσεις. Κατά τη διάρκεια της παρακολούθησης, που διήρκησε από 24 έως 68 μήνες, υποτροπή της νόσου παρουσίασε το 12,5% των ασθενών. Κατά την ολοκλήρωση της μελέτης, το 81% των ασθενών ήταν ελεύθερο νόσου, το 13% εξακολουθούσε να έχει νόσο και το 6% απεβίωσε. Από κάθε ασθενή λήφθησαν δύο βιοψίες, μία από καρκινικό ιστό και μία από παρακείμενο φυσιολογικό ιστό και τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν.Μέθοδος: Η μελέτη της έκφρασης της ακτίνης και των υποδοχεών CRH-R1, CRH-R2a, SV1 και pGHRH-R, σε γονιδιακό επίπεδο έγινε με τη χρήση συμβατικής PCR, rtRT-PCR και ηλεκτροφόρησης σε πηκτή αγαρόζης. Η μελέτη της έκφρασης των υποδοχέων σε πρωτεϊνικό επίπεδο έγινε μη τη βοήθεια ανοσοϊστοχημικής ανάλυσης. Αποτελέσματα: Οι υποδοχείς CRH-R1, CRH-R2a, SV1 και pGHRH-R ανιχνεύθηκαν σε ποσοστό 16,7%, 33,3%, 37% και 50%, αντίστοιχα, των βιοψιών των κακοήθων νεοπλασμάτων και σε 21,7%, 20,8%, 29,6% και 53,8%, αντίστοιχα, των βιοψιών των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών, χωρίς να παρουσιάζουν στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ τους. Κανένα CRH-R2b μετάγραφο δεν βρέθηκε. Τα επίπεδα έκφρασης των μεταγράφων των CRH-R1, CRH-R2a, SV1 και pGHRH-R ήταν 0,001023±0,001604, 0,36806255±0,770218392, 1,415537±2,032818 και 4,189554±10,4429, αντίστοιχα, στις βιοψίες των κακοήθων νεοπλασμάτων και 0,000226±0,000376, 0,066274±0,110313, 0,736±1,012704 και 10,12868±19,53721, αντίστοιχα, στις βιοψίες των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών, χωρίς να παρουσιάζουν στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ τους. Επίσης, δεν βρέθηκε στατιστικώς σημαντική διαφορά μεταξύ της ανίχνευσης του CRH-R1 και του CRH-R2a, καθώς και του SV1 και του pGHRH στους καρκινικούς ιστούς. Από την ανοσοϊστοχημική ανάλυση φάνηκε διαφορετική κατανομή των δύο υποδοχέων σε κυτταρικό επίπεδο. Κατά τη ανάλυση συσχέτισης της ανίχνευσης και του επιπέδου έκφρασης των υποδοχέων με τα δημογραφικά και κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών καθώς και με τα ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά των όγκων, αρνητική συσχέτιση βρέθηκε μεταξύ του επιπέδου έκφρασης του CRH-R1 και του αριθμού των τελειόμηνων κυήσεων και μεταξύ της ανίχνευσης του CRH-R2a και της ηλικίας εμμηνόπαυσης, ενώ θετική συσχέτιση μεταξύ του επιπέδου έκφρασης του CRH-R2a και της ηλικίας εμμηναρχής και μεταξύ του επιπέδου έκφρασης του SV1 και του ύψους. Από τη συσχέτιση των υποδοχέων μεταξύ τους βρέθηκε ότι, τα επίπεδα έκφρασης του υποδοχέα CRH-R1 σχετίζονταν αρνητικά με την ανίχνευση του υποδοχέα pGHRH-R και τα επίπεδα έκφρασης του υποδοχέα CRH-R2a σχετίζονταν θετικά με τα επίπεδα έκφρασης του υποδοχέα SV1. Η συσχέτιση της ανίχνευσης των υποδοχέων στους όγκους και του χρόνου εμφάνισης υποτροπής της νόσου καθώς και του συνολικού χρόνου επιβίωσης των ασθενών δεν κατέληξε σε στατιστικά σημαντικό αποτέλεσμα.Συμπεράσματα: Αποδείχθηκε η ύπαρξη και των δύο τύπων CRH υποδοχέων στα καρκινικά και παρακείμενα κύτταρα του μαστού, καθώς και της υποφυσιακής μορφής του υποδοχέα της GHRH και του splice variant αυτού, SV1. H ποσοτικοποίση της γονιδιακής έκφρασης δεν έδειξε στατιστικά σημαντικές διαφορές στα επίπεδα έκφρασης στον όγκο σε σχέση με τον παρακείμενο ιστό για όλους τους υποδοχείς. Η πιθανότητα εμφάνισης υποτροπής της νόσου και ο συνολικός χρόνος επιβίωσης των ασθενών δεν σχετίστηκε με την ύπαρξη των υποδοχέων των μελετηθέντων υποθαλαμικών ορμονών. Περαιτέρω μελέτες απαιτούνται για την ανάδειξη της χρησιμότητας τους ως θεραπευτικών στόχων στην αντιμετώπιση του καρκίνου του μαστού.