Μελέτη προκαρυωτικής ποικιλότητας στα ακραία περιβάλλοντα μιας αλυκής και των βιομηχανικών λυμάτων χρωμίου

Abstract

Life exists in all possible habitats on Earth even in those where one or more environmental parameters are unusually low or high making difficult the growth of most life forms. Extremophiles have developed the mechanisms permitting them to not only survive in such harsh conditions but to actually require them in order to grow. For a long time extremophiles were “terra incognita”. With the use of new techniques however such as DNA sequencing and high density DNA microarrays, study of even the most hostile habitats of the planet was possible. Since the environments with aggressive parameters were considered as a dead zone and microbial community investigation was focus in other more common environments. A major boost has been given to biotechnology and environmental applications with the finding of new biomolecules and organisms as a result of the study of these extreme environments. The aim of the current thesis was the study of microbial communities and their changes in relation to the conditions found in two extreme environments in Greece. Classic molecular microbiology (culture based) as well as novel molecular (16S rRNA libraries and high density DNA microarrays) techniques were used. The first was the hypersaline environment of the saltworks in Tourlida near Messolonghi and the second the extreme environment in a chrome plating industry. Microorganisms ranging from halotolerant bacteria at low salt concentrations to extreme halophilic bacteria and archaea, near the NaCl saturation point, were isolated from saltworks. Using 16S microarrays (Phylochip), the first time it was used in a saltwork, allowed for the detection of almost all bacterial as well as of the two archaeal phyla of Euryarchaeota and Crenarchaeota. Significant changes in the microbial community structure were found in this dynamic ecosystem with a unique prokaryotic diversity. Studying selected microorganisms from this saltwork can lead to the discovery of strains that are also resistant to other toxic compounds. These can be used for detoxification of high-salinity polluted areas or high salinity waste water. The use, for the first time, of DNA microarrays in chromium-polluted sites resulted in the detection of the highest bacterial diversity. Almost 70% of the orders detected were reported for the first time in such environments. Moreover, use of 16S rRNA libraries allowed for the detection of bacteria in the chromium plating tank which is actually the first report of a living organism in such an extreme concentration of hexavalent chromium. This in depth study of the present bacterial diversity provides the basis for the isolation of species with resistance in hexavalent chromium or of those that might have an important role in chromium reduction from waste water. More importantly, with the ever reducing sequencing cost together with single cell genomics, sequencing of bacterial genomes in such extreme chromium concentrations is now possible and could reveal the mechanism of chromium tolerance. Microbial Biodiversity can give a boost in Biotechnology and support novel sectors of our Nation’s Economy. Our country has a unique microbial wealth which remains largely unexplored. It is of major importance its detection, characterization, protection and exploitation in a way that it will lead to development of our Biological Economy.

Σε κάθε μέρος του πλανήτη υπάρχει ζωή ακόμα και στις περιοχές όπου μια η περισσότερες περιβαλλοντικές συνθήκες έχουν ασυνήθιστα χαμηλές η υψηλές τιμές με αποτέλεσμα να καθίστανται ακατάλληλες για την ανάπτυξη των περισσοτέρων μορφών ζωής. Οι ακραιόφιλοι μικροοργανισμοί που διαβιούν σε αυτές έχουν αναπτύξει τους κατάλληλους μηχανισμούς που τους επιτρέπουν όχι μόνο να επιβιώνουν άλλα ουσιαστικά να απαιτούν αυτές τις αντίξοες συνθήκες στο περιβάλλον τους προκείμενου να αναπτυχθούν. Για πολύ καιρό οι ακραιόφιλοι μικροοργανισμοί παρέμεναν άγνωστοι άλλα πλέον με τη χρησιμοποίηση νέων τεχνολογιών όπως αυτή των συγχρόνων τεχνικών αλληλούχισης DNA και των μικροσυστοιχιών DNA υψηλής πυκνότητας έγινε δυνατή η μελέτη της μικροβιακής ποικιλότητας σε βάθος ακόμη και από τις πιο αφιλόξενες περιοχές του πλανήτη. Η μελέτη των ακραίων οικοσυστημάτων και των οργανισμών που υπάρχουν σε αυτά έχει δώσει νέα ώθηση στη βιοτεχνολογία και τις περιβαλλοντικές εφαρμογές της με τον χαρακτηρισμό και χρησιμοποίηση νέων οργανισμών και βιομορίων. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη των μικροβιακών κοινοτήτων και των μεταβολών τους σε συνάρτηση με τις συνθήκες που επικρατούν κάθε φορά σε δυο ακραία περιβάλλοντα της χωράς μας τόσο με τεχνικές κλασικής μικροβιολογίας (με καλλιέργειες) όσο και με καινοτόμες μοριακές προσεγγίσεις όπως 16S rRNA βιβλιοθήκες και μικροσυστοιχίες DNA υψηλής πυκνότητας. Το πρώτο ακραίο περιβάλλον ήταν το υπεραλατούχο περιβάλλον των αλυκών στην Τουρλίδα, κοντά στο Μεσολόγγι ενώ το δεύτερο το τεχνητό ακραίο περιβάλλον που δημιουργείται από τη χρησιμοποίηση του εξασθενούς χρωμίου σε βιομηχανία επιμετάλλωσης. Από την αλυκή απομονώθηκαν αλοανθεκτικά βακτήρια σε μικρές τιμές αλατότητας. Επίσης απομονώθηκαν αλοανθεκτικά βακτήρια έως εξαιρετικά αλόφιλα βακτήρια και αρχαία κοντά στις συνθήκες κορεσμού NaCl. Με τις μικροσυστοιχίες DNA υψηλής πυκνότητας (PhyloChip) που εφαρμόστηκαν για πρώτη φορά στη μελέτη της μικροβιακής ποικιλότητας σε αλυκές επέτρεψαν την ανίχνευση σχεδόν όλων των βακτηριακών φύλων και των δυο από τα πέντε φυλά των αρχαίων, Euryarchaeota και Crenarchaeota. Οι σημαντικές αλλαγές στη δομή των μικροβιακών κοινοτήτων που βρέθηκαν στις αλυκές χαρακτηρίζουν ένα πολύ δυναμικό οικοσύστημα με ιδιαίτερη προκαρυωτική ποικιλότητα. Η μελέτη των απομονωμένων στελεχών από την υπεραλατούχο περιοχή μπορεί να αποτελέσει τη βάση για την εξέτασή τους ως προς την ενδεχομένη ικανότητα αποικοδόμησης τοξικών ενώσεων και χρησιμοποίησής τους σε επιβαρυμένες αλατούχες περιοχές ή σε εγκαταστάσεις επεξεργασίας αποβλήτων με υψηλή αλατότητα. Η εφαρμογή για πρώτη φορά των μικροσυστοιχιών σε περιβάλλον με χρώμιο αποκάλυψε τη μεγαλύτερη βακτηριακή ποικιλότητα με το 70% των τάξεων που ανιχνεύτηκε να αναφέρεται για πρώτη φορά παρουσία χρωμίου. Επίσης η χρησιμοποίηση των 16S rRNA βιβλιοθηκών επέτρεψε την ανίχνευση βακτηριακών κυττάρων στη δεξαμενή επιχρωμίωσης της βιομηχανίας και αποτελεί στην ουσία την πρώτη αναφορά ύπαρξης οργανισμών σε τόσο ακραίες συγκεντρώσεις εξασθενούς χρωμίου. Η σε βάθος μελέτη της βακτηριακής ποικιλότητας μπορεί να αποτελέσει τη βάση για την επιτυχή απομόνωση των στελεχών που φαίνεται να παρουσιάζουν μεγάλη ανθεκτικότητα στο εξασθενές χρώμιο άλλα και εκείνων που πιθανά να έχουν ενεργό ρολό στην απομάκρυνση του χρωμίου από τα απόβλητα. Τέλος με το κόστος της αλληλούχισης να μειώνεται και σε συνδυασμό με τη γονιδιωματική του ενός κυττάρου (single cell genomics) η αλληλούχιση του γονιδιώματος των βακτηρίων που ανιχνεύτηκαν στις ιδιαίτερα ακραίες τιμές εξασθενούς χρωμίου θα μπορέσει να μας αποκαλύψει το μοριακό μηχανισμό ανθεκτικότητας. Η Μικροβιακή Βιοποικιλότητα μπορεί να δώσει ώθηση στο χώρο της Βιοτεχνολογίας και να στηρίξει νέους τομείς της Εθνικής μας Οικονομίας. Η χώρα μας διαθέτει έναν μοναδικό μικροβιακό πλούτο ανεξερεύνητο μέχρι στιγμής. Αυτός ο μικροβιακός πλούτος αξίζει να ανιχνευτεί, να χαρακτηριστεί, να προστατευτεί και να αξιοποιηθεί ώστε να αποτελέσει κινητήριο μοχλό για τη Βιο-Οικονομία της χωράς μας.