Φασματοσκοπική μελέτη της προδιάγνωσης σε μοριακό επίπεδο βιοϋμένιων των δοντιών: επίδραση των ακτινοβολιών γ και laser

Abstract

A screening of the population for periopathogenic bacterias in the progression of the disease is currently unavailable. In this study ATR-FT-IR spectroscopy was used to analyze and characterize the most common group of predominantly bacteria, which were used without any pre-treatment. Bacteria were classified in Gram positive and Gram negative as well as aerobs end anaerobs and the spectra were recorded. Comparison of the spectra in the region 4000-400 cm-1 confirmed the biochemical differences of the bacteria due to the fluidity and aggregation of lipids, which consist their membrane. Major differences were observed in the spectral subrange 1800-1500 cm-1 region, where the characteristic bands of Amide I and Amide II groups appear. These important changes are characterized from bacteria conformation of secondary protein structure. All the observed changes are closely associated with the primary structure of proteins. Changes also were observed 1200-900 cm-1, where polysaccharides and DNA bands absorb, showed slight visible differences, while the spectral region 900-400 cm-1 showed the characteristic bands of each bacteria and their differentiation. According to the spectral data in the region 4000-400 cm-1 a spectral Data Base was developed, which was used to apply a sophisticated algorithm model aiming to differentiate and identify microorganisms within each sample. Samples of subgingival calculus were taken from periodontal patients. Each sample was examined both with PCR (Polymerase Chain Reaction) analysis and spectroscopic analysis for detection and identification of the bacteria. The results of both analyses were nearly identical. In this way the two analyses were compared with the FT-IR being better and faster. Irradiation of subgingival calculus with ionizing radiation showed a detrimental effect over the genetic code of bacteria, while the laser application destroyed tissues through ablation. In conclusion, FT-IR spectroscopy can be applied to characterize microbial environment of subgingival plaque in patients with periodontal disease, because it can provide information about their bacteria composition. The method is diagnostic and superior to PCR, since it takes much less time for analysis and it shows repeatability potential to frequent and long term following up of the patient. FT-IR spectroscopy is advantageous primarily in the initial manifestation of periodontal disease since effectiveness of therapeutic measures can be monitored.

Για την αντιμετώπιση της περιοδοντίτιδας δεν υπάρχουν προς το παρόν τεχνικές άμεσης και έγκυρης ανάλυσης της πορείας και εξέλιξης της νόσου. Στην παρούσα διατριβή χρησιμοποιείται η ATR-FT-IR φασματοσκοπία για την μελέτη των βακτηριδίων που απαντώνται στην υποουλική πλάκα ασθενών με περιοδοντίτιδα. Στην ATR-FT-IR το δείγμα χρησιμοποιείται όπως έχει και τα λαμβανόμενα φάσματα χαρακτηρίζονται για την επαναληψιμότητα των αποτελεσμάτων. Αφού τα βακτηρίδια κατατάχθηκαν σε Gram(+) και Gram(-) καθώς και σε αναερόβια και αερόβια λήφθηκαν τα υπέρυθρα φάσματα των βακτηριδίων και έγινε η αξιολόγησή τους. Από την σύγκριση των φασμάτων διαπιστώθηκαν σημαντικές αποκλίσεις μεταξύ των βακτηριδίων σε όλη την έκταση του φάσματος, οι οποίες αποδόθηκαν στις βιοχημικές διαφορές που εμφανίζουν τα βακτηρίδια μεταξύ τους. Από τις μεταβολές στην περιοχή του φάσματος 3000-2800 cm-1 επιβεβαιώθηκε ότι οι μεμβράνες των κυττάρων των βακτηριδίων διαφέρουν σημαντικά ως προς την ευκινησία. Στην περιοχή του φάσματος 1800-1500 cm-1, όπου εμφανίζονται οι ταινίες απορρόφησης των Amide Ι και II οι διαφορές ήταν σημαντικότερες και έδειχναν την διαφορετική διαμόρφωση της δευτεροταγούς δομής των πρωτεϊνών των βακτηριδίων. Σημαντικές επίσης ήταν οι διαφορές μεταξύ των φασμάτων των βακτηριδίων στην περιοχή 1200-900 cm-1, όπου αναμένονται οι ταινίες των πολυσακχαριτών και του DNA. Με βάση τις διαφορές που εμφάνιζαν τα βακτηρίδια σε όλη την περιοχή του φάσματος σχηματίσθηκε τράπεζα δεδομένων, η οποία αποτέλεσε την ανάπτυξη μαθηματικού αλγορίθμου για την αναγνώριση των βακτηριδίων σε μίγμα. Στη συνέχεια λήφθηκαν δείγματα τρυγίας ασθενών στα οποία έγινε PCR για την αναγνώριση των βακτηριδίων της υποουλικής πλάκας. Από τα ίδια δείγματα λήφθηκαν τα ATR-FT-IR φάσματα και τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με δεδομένα της PCR ανάλυσης. Διαπιστώθηκε πλήρης σύμπτωση των αποτελεσμάτων. Από την επίδραση των ιοντιζουσών ακτινοβολιών διαπιστώθηκε ότι καταστρέφεται ο γενετικός κώδικας των βακτηριδίων, ενώ το laser καταστρέφει τον ιστό κατά τρόπο που να μην είναι εφικτή η λήψη δείγματος. Από τα παραπάνω διαπιστώθηκε ότι η ATR-FT-IR φασματοσκοπία μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την μελέτη της τρυγίας ασθενών με επιθετική περιοδοντίτιδα. Ως διαγνωστική μέθοδος υπερέχει της PCR στην ταχύτητα και λόγω επαναληψιμότητας στη συχνή και μακροχρόνια παρακολούθηση του ασθενούς. Η μέθοδος προσφέρεται ιδιαίτερα στα πρώτα στάδια της νόσου, ώστε να φανεί η αποτελεσματικότητα της θεραπείας.