Λειτουργικός χαρακτηρισμός πρωτεϊνών του εκκριτικού συστήματος τύπου III του φυτοπαθογόνου βακτηρίου Pseudomonas syringae pv. phaseolicola

Abstract

Type III secretion system (TTSS) is a specialized multiprotein complex which is found in Gram- bacteria and mediates the secretion/translocation of proteins (effectors) directly from the bacterial to the eukaryotic cytoplasm. In phytopathogenic bacteria, the TTSS is essential for pathogenesis and is encoded by a cluster of genes located in the hrp/hrc pathogenicity island. In the present study, the phytopathogenic bacterium Pseudomonas syringae pv. phaseolicola (Psph) was used as a model for the structural and functional characterization of TTSS proteins. The avrPphF operon of Psph encodes a ΤΤSS chaperone/cognate effector protein pair (AvrPphF_ORF1/ORF2). The ORF1-ORF2 complex was detected in vivo, via yeast two-hybrid analysis, as well by co-purification from Escherichia coli. Formation of ORF1-ORF2 complex in vitro requires proper refolding of the proteins which seem to participate in a 2:1 ratio, consistent with a chaperone/substrate complex profile for TTSS secretion. The AvrPphF_ORF1 protein binds in the first 55 N-terminal residues of AvrPphF_ORF2 whereas the 42-55 residue region of the latter protein appear to be critical for this interaction. HrcQΒ is a conserved component of the TTSS core and its C-terminal region (HrcQB-C, residues 50-128) forms stable tetramers in crystals while the homologous protein (FliN) from Thermotoga maritima forms homodimers. Accordingly, we investigated if the biologically significant unit of HrcQB-C is a tetramer or lower or higher order complexes by constructing four site-directed mutants, aiming at the disruption or the destabilization of the tetrameric association. Three mutants, although still capable of forming homo-tetramers of the same hydrodynamic radius as those of the native protein, displayed a certain degree of heterogeneity of the molecular population and different thermostability compared to the native molecule in solution. The site-directed insertion of tryptophan residues in HrcQB-C, which lacks aromatic aminoacids, allowed the collection of near UV circular dichroism spectra which support the hypothesis that the solution tetramer resembles that in the HrcQB-C crystal. The ΗrpΕ protein, while is not listed among the conserved components of the secretion apparatus, seems to play an important and functionally conserved role in TTSS secretion. In the present study, we investigated the structural characteristics of the protein and demonstrated its ability to self-associate in vivo and in vitro as well as to interact physically with the HrpO and HrcN proteins. The construction of a series of truncated forms of HrpE allowed us to sketch a probable oligomerization pattern in solution and to localize the regions of the molecule which participate in these interactions. In addition, the subcellular localization of HrpE and its effect at the ATPase activity of HrcN, determined in this study, in combination with the data from studies on flagellar or non-flagellar TTSS led to a hypothetical model which outlines the role of these interactions in the function of the secretion apparatus.

Το εκκριτικό σύστημα τύπου ΙΙΙ (Type III secretion system, TTSS) απαντάται σε Gram- βακτήρια και ευθύνεται για την έκκριση ή/και μεταφορά πρωτεϊνών απευθείας από το βακτηριακό στο ευκαρυωτικό κυτταρόπλασμα. Το ΤΤSS είναι μια πρωτεϊνική υπερδομή που δομείται από 20-25 πρωτεΐνες και εδράζεται στο βακτηριακό κυτταρικό φάκελο. Στα φυτοπαθογόνα βακτήρια το ΤΤSS σχετίζεται με την παθογένεια και κωδικοποιείται από τη γονιδιακή νησίδα hrp/hrc. Το φυτοπαθογόνο βακτήριο Pseudomonas syringae pv. phaseolicola (Psph) χρησιμοποιήθηκε ως μοντέλο στην παρούσα διατριβή για το δομικό και λειτουργικό χαρακτηρισμό επιμέρους συστατικών της εκκριτικής συσκευής. Το οπερόνιο avrPphF της Psph κωδικεύει ένα ζεύγος σαπερόνης/συγγενούς πρωτεΐνης-τελεστή (AvrPphF_ORF1/ORF2) του TTSS. Το σύμπλοκο ORF1-ORF2 ανιχνεύτηκε in vivo τόσο στο σακχαρομύκητα, χρησιμοποιώντας το σύστημα των δύο υβριδίων, όσο και μετά από συνέκφραση και συγκαθαρισμό από την Escherichia coli. Οι δύο πρωτεΐνες φαίνεται να συμμετέχουν στο συγκαθαριζόμενο σύμπλοκο με αναλογία 2ORF1:1ORF2, όπως άλλα σύμπλοκα σαπερόνης/υποστρώματος των TTSS. Η περιοχή πρόσδεσης της AvrPphF_ORF1 εντοπίζεται στα 55 αμινοτελικά κατάλοιπα της AvrPphF_ORF2, ενώ η περιοχή 42-55 aa φαίνεται να είναι κρίσιμη για την αλληλεπίδραση των δύο μορίων. Η πρωτεΐνη HrcQΒ ανήκει στο συντηρημένο πυρήνα της εκκριτικής συσκευής και η καρβοξυτελική της περιοχή (HrcQB-C, κατάλοιπα 50-128) σχηματίζει σταθερά τετραμερή σύμπλοκα σε κρυστάλλους, σε αντίθεση με την ομόλογή της (FliN) από τη Thermotoga maritima η οποία σχηματίζει ομοδιμερή. Για να διερευνηθεί αν η βιολογικά ενεργή μονάδα της HrcQB-C είναι το τετραμερές ή μικρότερης ή και μεγαλύτερης τάξης σύμπλοκα, κατασκευάστηκαν τέσσερα στοχευμένα μεταλλάγματα της πρωτεΐνης και διερευνήθηκε η ολιγομερική τους κατάσταση σε διάλυμα. Τα τρία από αυτά, σχηματίζουν ομοτετραμερή της ίδιας υδροδυναμικής ακτίνας με τη φυσικού τύπου πρωτεΐνη αλλά με πιο ετερογενή μοριακό πληθυσμό και διαφοροποιημένη θερμοσταθερότητα. Η στοχευμένη εισαγωγή καταλοίπων τρυπτοφάνης στη HrcQB-C, η οποία στερείται αρωματικών καταλοίπων, επέτρεψε τη συλλογή φασμάτων κυκλικού διχρωισμού στο εγγύς υπεριώδες που στηρίζουν την υπόθεση ότι η τριτοταγής διευθέτησή της σε διάλυμα προσομοιάζει εκείνη της κρυσταλλικής δομής. Η πρωτεΐνη ΗrpΕ, που δεν κατατάσσεται στην ομάδα των συντηρημένων συστατικών του TTSS, αλλά φαίνεται να διαδραματίζει σημαντικό και συντηρημένο λειτουργικό ρόλο στο μηχανισμό της έκκρισης, ιδιο-συνδέεται in vivo και in vitro και αλληλεπιδρά με τις πρωτεΐνες HrpO και HrcN. Η κατασκευή ελλειμμάτων της πρωτεΐνης HrpE επέτρεψε τη σκιαγράφηση ενός πιθανού πρότυπου ολιγομερισμού της σε διάλυμα και τον εντοπισμό επιμέρους περιοχών της που συμμετέχουν στις αλληλεπιδράσεις αυτές. Επιπλέον, η υποκυτταρική θέση της HrpE και η επίδρασή της στην ενεργότητα ΑΤΡάσης της HrcN, σε συνδυασμό με δεδομένα από μελέτες σε μαστιγιακά και μη TTSS οδήγησαν σε ένα υποθετικό μοντέλο που σκιαγραφεί το ρόλο των αλληλεπιδράσεων αυτών στο μηχανισμό λειτουργίας της εκκριτικής συσκευής.