Περίληψη
Σε μια προσπάθεια να κατασκευαστούν εξειδικευμένοι αναστολείς ή ενεργοποιητές της κυτταρικής σηματοδότησης των οπιοειδών υποδοχέων, αλλά και άλλων υποδοχέων που συζεύγνυνται με G πρωτεΐνες και χρησιμοποιούν τις ίδιες με τους οπιοειδείς Gi/Go πρωτεΐνες δημιουργήσαμε ένα μικρογονίδιο που κωδικοποιεί την τρίτη ενδοκυτταρική θηλιά του δ- οπιοειδούς υποδοχέα (δ-i3L). Επιπλέον κατασκευάσαμε ένα πολυκλωνικό αντίσωμα που αναγνωρίζει τους οπιοειδείς υποδοχείς. Με το συγκεκριμένο μικρογονίδιο επιμολύναμε κύτταρα θηλαστικών που εξέφραζαν και τους οπιοειδείς υποδοχείς και διαπιστώσαμε ότι το δ-i3L αναγνωρίζει και αλληλεπιδρά αφενός με τους οπιοειδείς υποδοχείς και αφετέρου με τις Go, αλλά δεν συνδέεται με τις Gs πρωτεΐνες. Με μελέτες θερμού και ψυχρού κορεσμού βρήκαμε ότι η παρουσία του δ-i3L δεν επηρεάζει την συγγένεια πρόσδεσης (kd) αγωνιστών και ανταγωνιστών στους οπιοειδείς υποδοχείς αλλά τους οδηγεί στην κατάσταση χαμηλής συγγένειας πρόσδεσης. Όσον αφορά την ενεργοποίηση των G πρωτεϊνών, με τ ...
Σε μια προσπάθεια να κατασκευαστούν εξειδικευμένοι αναστολείς ή ενεργοποιητές της κυτταρικής σηματοδότησης των οπιοειδών υποδοχέων, αλλά και άλλων υποδοχέων που συζεύγνυνται με G πρωτεΐνες και χρησιμοποιούν τις ίδιες με τους οπιοειδείς Gi/Go πρωτεΐνες δημιουργήσαμε ένα μικρογονίδιο που κωδικοποιεί την τρίτη ενδοκυτταρική θηλιά του δ- οπιοειδούς υποδοχέα (δ-i3L). Επιπλέον κατασκευάσαμε ένα πολυκλωνικό αντίσωμα που αναγνωρίζει τους οπιοειδείς υποδοχείς. Με το συγκεκριμένο μικρογονίδιο επιμολύναμε κύτταρα θηλαστικών που εξέφραζαν και τους οπιοειδείς υποδοχείς και διαπιστώσαμε ότι το δ-i3L αναγνωρίζει και αλληλεπιδρά αφενός με τους οπιοειδείς υποδοχείς και αφετέρου με τις Go, αλλά δεν συνδέεται με τις Gs πρωτεΐνες. Με μελέτες θερμού και ψυχρού κορεσμού βρήκαμε ότι η παρουσία του δ-i3L δεν επηρεάζει την συγγένεια πρόσδεσης (kd) αγωνιστών και ανταγωνιστών στους οπιοειδείς υποδοχείς αλλά τους οδηγεί στην κατάσταση χαμηλής συγγένειας πρόσδεσης. Όσον αφορά την ενεργοποίηση των G πρωτεϊνών, με τα πειράματα μας αποδείξαμε ότι η παρουσία του δ-i3L στα κύτταρα που εξέφραζαν τους υποδοχείς είχε σαν συνέπεια να μην ενεργοποιούνται οι Gi/Go πρωτεΐνες ούτε από τους ομόλογους με την τρίτη ενδοκυτταρική θηλιά οπιοειδείς αλλά ούτε και από τους ετερόλογους α₂-αδρενεργικούς υποδοχείς. Στο επίπεδο των τελεστών διαπιστώσαμε ότι η έκφραση του δ-i3L μικρογονιδίου είχε σαν αποτέλεσμα την παρεμπόδιση της δράσης της αδενυλικής κυκλάσης μετά από ενεργοποίηση των οπιοειδών και του a₂-AR υποδοχέα, ενώ δεν είχε καμία επίδραση στην δράση της αδενυλικής κυκλάσης μετά από ενεργοποίηση του β₂- αδρενεργικού υποδοχέα ο οποίος αλληλεπιδρά με τις Gs πρωτεΐνες, γεγονός που ενισχύει την υπόθεση μας ότι το δ-i3L μικρογονίδιο στοχεύει ειδικά στις Gi/Go πρωτεΐνες και όχι στον ίδιο τον τελεστή. Η χρήση του μεταλλαγμένου R261 Aδ-i3L μικρογονιδίου στις μελέτες ενεργοποίησης της αδενυλικής κυκλάσης μας έδειξε ότι η αργινίνη 261 δεν είναι το καθοριστικό αμινοξύ για την αλληλεπίδραση υποδοχέα-G πρωτεΐνης. Μελετώντας την δράση του δ-i3L στην ενεργοποίηση της φωσφολιπάσης C, που είναι ένας άλλος τελεστής των οπιοειδών, διαπιστώσαμε ότι η ενεργοποίηση της PLC και η απελευθέρωση του Ca²⁺ από τους οπιοειδείς υποδοχείς παρεμποδίζεται στα κύτταρα που εκφράζουν και το δ-i3L μικρογονίδιο, ενώ δεν παρατηρήθηκε παρεμπόδιση στην ενεργοποίηση της PLC από τον Μ₁-μουσκαρινικό υποδοχέα που ως γνωστόν μετάγει το σήμα του μέσω των Gq πρωτεϊνών. Τέλος, το δ-i3L μικρογονίδιο χρησιμοποιήθηκε προκειμένου να μελετηθεί ο μηχανισμός ενεργοποίησης των ERK1/2 κινασών τόσο από τους οπιοειδείς όσο και από τον α₂-αδρενεργικό και τον EGF υποδοχέα. Διαπιστώσαμε ότι η φωσφορυλίωση των ERK1/2 κινασών από τους δ- και μ- οπιοειδείς υποδοχείς περιλαμβάνει την συμμετοχή των α υπομονάδων των G πρωτεϊνών και η ενεργοποίηση αυτή παρεμποδίζεται από την παρουσία του δ-i3L μικρογονιδίου καθώς και μετά από κατεργασία των κυττάρων με ΡΤΧ. Το δ-i3L μικρογονίδιο δεν έχει καμία επίδραση στην ενεργοποίηση των ERK1/2 κινασών από τον α₂-αδρενεργικό υποδοχέα, γεγονός που υποδηλώνει την ενδεχόμενη συμμετοχή άλλων πρωτεϊνών όπως π.χ. οι Gβγ υπομονάδες. Επιπλέον, η μηδενική επίδραση του δ-i3L μικρογονιδίου στην φωσφορυλίωση των ERK1/2 κινασών μετά από ενεργοποίηση του EFG υποδοχέα φανερώνει ότι στο συγκεκριμένο σηματοδοτικό μονοπάτι δεν συμμετέχουν οι α υπομονάδες των Gi/Go πρωτεϊνών. Συμπερασματικά τα πειραματικά μας δεδομένα μας υποστηρίζουν ότι το δ-i3L μικρογονίδιο είναι ένα εξειδικευμένο μοριακό εργαλείο που μπορεί να χρησιμοποιηθεί σαν πιθανός παρεμποδιστής της σηματοδότησης όχι μόνο των οπιοειδών αλλά και άλλων υποδοχέων οι οποίοι συζεύγνυνται με τον ίδιο Gi/Go πληθυσμό των G πρωτεϊνών.
περισσότερα