Βιολογικές ιδιότητες στελεχών στρεπτόκκοκου ομάδας Β από εγκύους και νεογέννητα με συμβατικές και σύγχρονες μοριακές μεθόδους

Abstract

Group B Streptococcus (GBS) is a major cause of neonatal sepsis and meningitis, exhibiting considerable morbidity and mortality. A lot of studies are currently conducted for the development of a vaccine against the pathogenic serotypes. The absence of organized study for GBS to Greece, imposed the planning of the present epidemiological study based to the most recent microbiological, epidemiological and molecular methods. Insufficient data are presently available concerning the prevalence of GBS isolates among pregnant women and their neonates in Greece.Therefore, the aim of this study was to evaluate: a) the prevalence and risk factors of maternal and infant colonization in our Greece, b) the serogroup distribution, c) the susceptibility to penicillin, d) the resistance to macrolides and the rensponsible genes and e) the molecular analysis of the major serotype II.The material of the present study included 76 GBS strains. 67 strains were isolated from the lower vagina and/or the rectum of 1014 pregnant women in Athens and Northern Greece. Nine strains were isolated from the blood, ear canal, throat and umbilicus of neonates born by the women enrolled in the study. Serotyping was performed by the use of a coagglutination method, utilizing antisera against types I-VIII, provided by the Statens Serum Institut, Denmark. Susceptibility to antibiotics (penicillin, erythromycin, clindamycin) was determined by a disk diffusion method and MIC was determined by E-test (AB, Biodisk, Sweden). The results of both methods were interpreted according to the NCCLS recommendations. MLSb resistance was determined by the double disk test using erythromycin and clindamycin disks and the presence of resistance genes was evaluated by PCR amplification. Finally, PFGE of DNA digested with Smal restriction enzyme was performed on 15 serotype II GBS isolates.GBS were isolated from 67 pregnant women, and the overall colonization rate was 6.6%. The colonization rate was significantly higher among women of a higher socio-economic level. The overall infant colonization rate was 2.1% and the rate of vertical transmission was 18.7%.The serotype distribution of 67 GBS strains was as follows: la 19%, lb 12%, II 27%, III 22%, IV 3%, V 9%, VI 3%, VII 3%, Vili 1%. The nine colonized neonates carried the same serotype as their mothers.All strains were susceptible to penicillin, 4.5% (3/67) were found resistant to erythromycin and 6% (4/67) to both erythromycin and clindamycin. Resistance genes were identified in two of the four isolates. Erm TR was found in a strain with an in ducible resistance phenotype (IR) and ermB in a strain with a constitutive resistance phenotype (CR).PFGE typing of 15 serotype II GBS isolates yielded ten distinct patterns: A, B, C(in five isolates), D, E, F, G, Η, I, K (in two isolates). Two isolates among the five presenting pattern C and two exhibiting pattern K belonged to pairs of neonates and their own mothers, suggesting that these pairs were colonized by the same clone of GBSThe maternal colonization rate was found low in our country, in accordance to the low rates of some Mediterranean and other developing countries, but much lower than the ones recorded in USA. Low maternal colonization rates and extended use of antibiotics may be associated with low vertical transmission and the low incidence of neonatal disease.Serotype distribution was almost even between II and III (49%). A considerable proportion was resistant to erythromycin and clindamycin, supporting the use of penicillin for the prevention and treatment of GBS infections and imposing the susceptibility test for macrolides. It is also important that there was no significant difference in the rate of resistance between the different serotypes. Furthermore, excluding the pairs of mothers-neonates colonized by the same clone of GBS, genetic diversity among major serotype II isolates was exhibited.

Ο Στρεπτόκοκκος ομάδας B (GBS), είναι ένα από τα αίτια σοβαρών νεογνι- κών λοιμώξεων, όπως σηψαιμίας και μηνιγγίτιδας. Καταβάλλονται διεθνώς προσπάθειες για την παρασκευή εμβολίου, το οποίο θα βοηθήσει στην πρόληψη των σχετικών λοιμώξεων. Η απουσία εμπεριστατωμένης μελέτης για το μικρόβιο αυτό στην Ελλάδα, κατέστησε επιτακτικό το σχεδίασμά της παρούσας επιδημιολογικής μελέτης, η οποία συμπεριλαμβάνει τις πιο πρόσφατες μικροβιολογικές, επιδημιολογικές και μοριακές μεθόδους.Σκοπός της μελέτης ήταν να καταγραφούν: α) τα ποσοστά αποικισμού στις εγκύους την 35η-37η εβδομάδα και τα νεογέννητα, β) η συχνότητα των διαφόρων οροτύπων των στελεχών GBS που απομονώνονται στην Ελλάδα από εγκύους και νεογνά, γ) η ευαισθησία τους στην πενικιλλίνη, δ) η αντοχή τους στις μακρολίδες και τα γονίδια στα οποία οφείλεται, και ε) η γενετική τυποποίηση στελεχών του μείζονος οροτύπου II.Υλικό της μελέτης απετέλεσαν 76 στελέχη GBS. Από αυτά, 67 απομονώθηκαν από καλλιέργειες κολπικού ή/και ορθικού επιχρίσματος 1014 εγκύων από την Αθήνα και τη Δράμα. Εννέα στελέχη απομονώθηκαν από καλλιέργειες αίματος, ομομφαλικού, φαρυγγικού και ωτικού επιχρίσματος νεογνών, των οποίων οι μητέρες ήταν αποικισμένες με GBS. Ο διαχωρισμός σε εννέα οροτύπους (Ια, Iß, II-VIII), έγινε με τη μέθοδο Lancefield και χρησιμοποιήθηκαν αντιοροί έναντι του πολυσακχαριδικού αντιγόνου επιφάνειας (Statens Serum Institut, Denmark). Ο έλεγχος της ευαισθησίας στα αντιβιοτικά πενικιλλίνη, ερυθρομυκίνη και κλινδαμυκίνη, έγινε με τη μέθοδο διάχυσης στο άγαρ (σύμφωνα με τις οδηγίες της NCCLS) και της MIC με E-test (AB Biodisc, Sweden). Ο έλεγχος της αντοχής ειδικά σε μακρολίδες και λινκοσαμίδες, έγινε με τη μέθοδο δύο δισκίων (ερυθρομυκίνη, κλινδαμυκίνη) σε άγαρ και η ανίχνευση των αντίστοιχων γονιδίων με PCR. Ακολούθησε γενετική τυποποίηση 15 στελεχών οροτύπου II, με PFGE μετά από πέψη με την περιοριστική ενδονουκλεάση Smal.Από τις εγκύους που εξετάστηκαν, φορείς Στρεπτόκοκκου ομάδας Β ήταν οι 67 (6,6%). Υψηλότερο ποσοστό εμφάνιζαν οι γυναίκες υψηλότερης κοινωνικοοικονομικής τάξης. Το συνολικό ποσοστό αποικισμού ήταν 2,1% και αυτό της κάθετης μετάδοσης 18,7%.Τα 67 στελέχη των μητέρων κατετάγησαν στους εξής οροτύπους: Ια 19%, Ιβ 12%, II 27%, III 22%, IV 3%, V 9%, VI 3%, VII 3%, Vili 1%. Τα εννέα αποικισμέ- να νεογνά έφεραν τον ίδιο ορότυπο με τις μητέρες τους.Όλα τα στελέχη ήταν ευαίσθητα στην πενικιλλίνη, ενώ αντοχή παρατηρήθηκε στην ερυθρομυκίνη (10%) και στην κλινδαμυκίνη (6%): 4% (3/67) των στελεχών ήταν ανθεκτικά στην ερυθρομυκίνη και 6% (4/67) ήταν ανθεκτικά και στα δύο αντιβιοτικά. Γονίδια αντοχής ανιχνεύτηκαν σε δύο από τα τέσσερα αυτά στελέχη. Το ermTR βρέθηκε σε στέλεχος που είχε φαινότυπο επαγώγιμης αντοχής (IR) και το ermtì σε στέλεχος με φαινότυπο ιδιοσυστασιακής αντοχής (CR).Στα στελέχη τύπου II βρέθηκαν δέκα ηλεκτροφορητικοί τύποι: A, Β, Γ (πέντε στελέχη), Δ, E, Ζ, Η, Θ, I, Κ (δύο στελέχη). Τα δύο από τα πέντε στελέχη τύπου Γ, όπως και τα δύο στελέχη τύπου Κ προέρχονταν από ζευγάρι μητέρας-παιδιού.Από τα παραπάνω συμπεραίνουμε ότι το συνολικό ποσοστό αποικισμού από Streptococcus agalactiae στις εγκύους ήταν χαμηλό (7%), ποσοστό παραπλήσιο με αυτά των αναπτυσσόμενων χωρών και των χωρών της Μεσογείου και πολύ μικρότερο από τα ποσοστά στην Αμερική. Οι διαφορές αυτές μπορεί να οφείλονται σε διαφορές στην κουλτούρα, τη σεξουαλική συμπεριφορά και τους τρόπους υγιεινής που απορρέουν από αυτές, μαζί με διαφορές στα γενετικά χαρακτηριστικά των στελεχών που αποικίζουν τον πληθυσμό της κάθε χώρας. Στα χαμηλά ποσοστά αποικισμού και στην ευρεία χρήση αντιβιοτικών οφείλονται μάλλον και η μειωμένη κάθετη μετάδοση αλλά και η μειωμένη επίπτωση λοιμώξεων στα νεογέννητα από GBS.Οι συχνότεροι ορότυποι ήταν οι II και III (49%), ενώ η αντοχή στην ερυθρομυκίνη και στην κλινδαμυκίνη (που είναι η εναλλακτική αγωγή σε αλλεργικές στην πενικιλλίνη εγκύους) ήταν σημαντική, γι’αυτό συνιστάται προηγουμένως έλεγχος ευαισθησίας. Σημαντικό επίσης είναι ότι δεν υπήρχε σημαντική συσχέτιση μεταξύ αντοχής και οροτύπων και ότι τα στελέχη GBS οροτύπου II, αν εξαιρέσουμε τα ζεύγη μητέρας-παιδιού, παρουσιάζαν αξιόλογη γονοτυπική ετερογένεια.