Επίδραση ανοσορρυθμιστικών και αντινεοπλασματικών παραγόντων στη βλαστική μεταμόρφωση λεμφοκυττάρων αίματος

Abstract

The purpose of the study presented was the development of the peripheral blood lymphocyte transformation assay, which determines the extent of lymphocyte blast transformation in vitro, for the purpose of being used in the Laboratory of Experimental Pharmacology for the pharmacological investigation of the effect of immunoregulatory and antineoplastic agents and for the purpose of screening new compounds for potential immunomodulating properties. The experimental procedure was based on the evaluation of the extent of lymphocyte activation, using morphological criteria, and after cultivation in the presence of the mitogen PHA, of samples containing whole blood which came from 13 different healthy donors, one patient with chronic lymphocytic leukemia and 9 rabbits, and the comparison of the results between the two species.Along with the resting unactivated lymphocytes and the activated lymphoblasts, a third category of cells was observed and evaluated, those which were designated as aberrant cells, and which were associated with the result of cytotoxic phenomenon. It was also observed that the particular methodology used was capable of detecting spontaneous blastogenesis of lymphocytes. The age of the donors, the gender and smoking did not affect lymphocyte activation, while with the human blood samples, as opposed to the samples using rabbit blood, a seasonal variation of the blastogenesis was observed, which was found to be statistically significantly decreased during the winter compared to the other seasons.The dose-dependent inhibition of lymphocyte activation by cyclosporin A (CsA), as was observed using both human and rabbit blood, as well as the inhibition of activation by antineoplastic drugs, verified the reliability of the methodology used for the investigation of the action of immunosuppressant drugs and for the preliminary screening of newly discovered compounds with potential immunomodulatory action. In particular, as was observed using human lymphocytes, the biphasic dose-response relationship to CsA and the effect of molybdate ions on that relationship demonstrated the complexity of the mechanisms involved in the regulation of the action of immunosuppressant drugs, as well as the capability of the method used to investigate these mechanisms. The dose-dependent inhibition of lymphocyte blastogenesis caused by prednisolone confirmed these observations, while the lack of inhibitory effect of rapamycin showed that the methodology used was useful in the investigation of early events of of lymphocyte activation, which are connected to the morphological phenomenon of lymphocyte blast transformation. These results, along with the observed inhibition of activation by tamoxifen and the lack of effect by /2-estradiol, validate the reliability of the lymphocyte blastogenesis assay for use in the preliminary screening of 5 newly isolated natural compounds for possible immunomodulatory/cytotoxic action.In conclusion, the evaluation of lymphocyte activation through the morphological phenomenon of blast transformation offered information concerning the mechanism of action of known immunomodulatory agents, and was useful in detecting the immunomodulatory action of newly discovered agents. The quantification of the aberrant cells showed that this method also offers a means of simultaneous evaluation of the possible cytotoxic action of various drugs and new substances.

Σκοπός της διατριβής ήταν η ανάπτυξη στο Εργαστήριο Φαρμακολογίας της μεθοδολογίας αξιολόγησης της διέγερσης λεμφοκυττάρων περιφερικού αίματος, μέσω προσδιορισμού της βλαστικής μεταμόρφωσης in vitro, προκειμένου να χρησιμοποιηθεί για τη φαρμακολογική διερεύνηση της δράσης ανοσορρυθμιστικών και αντινεοπλασματικών παραγόντων και τον αρχικό έλεγχο νέων ουσιών για πιθανή ανοσορρυθμιστική δράση. Το πειραματικό πρότυπο βασίστηκε στην αξιολόγηση του βαθμού της λεμφοκυτταρικής διέγερσης, με μορφολογικά κριτήρια, κατόπιν καλλιέργειας, παρουσία της μιτογόνου ουσίας PHΑ, δειγμάτων πλήρους αίματος που προέρχονταν από 13 υγιείς δότες, μία ασθενή με χρόνια λεμφογενή λευχαιμία και 9 κονίκλους, και στη σύγκριση των αποτελεσμάτων μεταξύ των δύο ειδών.Εκτός από τα μη διεγερμένα λεμφοκύτταρα και τους διεγερμένους βλάστες, παρατηρήθηκε και προσδιορίσθηκε ποσοτικά μια τρίτη κατηγορία, αυτή των άτυπων κυττάρων, τα οποία συνδέθηκαν με την εμφάνιση κυτταροτοξικών φαινομένων. Διαπιστώθηκε επίσης ότι η χρησιμοποιούμενη μεθοδολογία ήταν επαρκής για την ανίχνευση της αυτόματης λεμφοκυτταρικής διέγερσης. Η ηλικία των δοτών, το φύλο και το κάπνισμα δεν επηρέασαν τη λεμφοκυτταρική διέγερση, ενώ στο ανθρώπινο αίμα, σε αντίθεση με το αίμα των κονίκλων παρατηρήθηκε εποχιακή διακύμανση στη βλαστογένεση, η οποία βρέθηκε στατιστικά σημαντικά μειωμένη το χειμώνα σε σχέση με τις υπόλοιπες εποχές του έτους.Η δοσοεξαρτώμενη αναστολή της λεμφοκυτταρικής διέγερσης από την κυκλοσπορίνη-Α (CsA), στο αίμα των ανθρώπων και των κονίκλων, καθώς και η αναστολή από αντινεοπλασματικούς παράγοντες επιβεβαίωσε την αξιοπιστία της μεθοδολογίας για τη διερεύνηση της δράσης των ανοσοκατασταλτικών φαρμάκων και για τον αρχικό έλεγχο νέων ουσιών με πιθανή ανοσορρυθμιστική δράση. Ιδιαίτερα, στα ανθρώπινα λεμφοκύτταρα, η διφασικότητα στη σχέση δόσης-ανταπόκρισης της CsA και η επίδραση των ιόντων μολυβδαινίου στη σχέση αυτή, έδειξαν την πολυπλοκότητα των μηχανισμών που ρυθμίζουν τη δράση των ανοσοκατασταλτικών φαρμάκων, καθώς και τη χρησιμότητα της μεθοδολογίας για τη διερεύνηση των μηχανισμών αυτών. Η δοσοεξαρτώμενη καταστολή της βλαστογένεσης από την πρεδνιζολόνη επιβεβαίωσε τις παρατηρήσεις αυτές, ενώ η έλλειψη δράσης της ραπαμυκίνης έδειξε ότι η μεθοδολογία είναι ικανή να μελετήσει τα αρχικά γεγονότα της λεμφοκυτταρικής διέγερσης που σχετίζονται με το μορφολογικό φαινόμενο της βλαστικής μεταμόρφωσης. Σε συνδυασμό με τα αποτελέσματα αυτά, η αναστολή της διέγερσης από την ταμοξιφαίνη και η απουσία δράσης της /λοιστραδιόλης τεκμηρίωσαν την αξιοπιστία του πειραματικού προτύπου κατά των αρχικό έλεγχο 5 νέων φυσικών προϊόντων για πιθανή ανοσορρυθμιστική/κυτταροτοξική δράση.Συμπερασματικά, η μέθοδος αξιολόγησης της λεμφοκυτταρικής διέγερσης μέσω του μορφολογικού φαινομένου της βλαστικής μεταμόρφωσης προσέφερε πληροφορίες για το μηχανισμό δράσης γνωστών ανοσορρυθμιστικών παραγόντων και για την ανίχνευση νέων ουσιών με ανοσορρυθμιστική δράση. Ο προσδιορισμός των άτυπων κυττάρων έδειξε ότι η μεθοδολογία αυτή προσφέρει ταυτοχρόνως ένα μέτρο αξιολόγησης της κυτταροτοξικής δράσης φαρμάκων και νέων ουσιών.