Αναζήτηση του είδους και της συχνότητας των μοριακών διαταραχών του γονιδίου CYP21A2 ( ΣΥΕ ) στο γενικό πληθυσμό, σε διάφορες περιοχές της Ελλάδος: δημιουργία βάσης δεδομένων για εφαρμογή εξέτασης διαλογής για ΣΥΕ ( screening ) στον ελληνικό πληθυσμό

Abstract

Defective steroidogenesis caused by mutations of the 21-hydroxylase gene (CYP21Α2), is the most common cause of congenital adrenal hyperplasia (CAH), covering about 95% of cases of CAH. Data on the gene frequency based on molecular studies are scarce. AIM OF THE STUDY The aim of our study was to determine the CYP21Α2 gene defects, their frequencies and the geographic distribution in the Hellenic population, a finding of theoretical and practical importance for genetic counseling. SUBJECTS AND METHODS Blood samples from unrelated neonates were obtained from maternity hospitals around Greece, during the period 2002-2004. DNA analysis has been carried out in 908 chromosomes. Allele-specific PCR was employed to identify 12 molecular defects of the CYP21A2 gene: homozygous deletion/conversion, P30L and W22X (exon1), I2spice (intron 2), 8bpdE3 (exon3), I172N (exon4), ClusterE6 (exon6), V281L and F306+T (exon7), Q318X and R356W (exon8), P453S (exon10) and two polymorfisms ( K102R, S268T ). We have previously shown that these mutations account for 97% of CYP21A2 defects in Greek patient population. RESULTS 47 mutant alleles (5.2%) were detected, all in the heterozygous state. 15 mutant alleles (1.6%) carried mutations associated with the classical (C) form of 21-hydroxylase deficiency; 11 Q318X (1,2%), 2 I172N (0,22%), 1 Ι2splice (0,11%), 1 W22X (0,11%). 32 mutant alleles (3.5%) carried mutations concordant with the non classical (NC) form of the disease; 19 V281L (2.1%), 9 P453S (0.99%) and 4 P30L (0.44%). 9.9% of our subjects were found to be carriers of molecular defects of 21-hydroxylase deficiency. The heterozygote frequency for C form was 3.1% and for NC forms 6.8%. We estimated in the Hellenic population the incidence for the NC form is 1:416 and for C form 1:3,3663. The calculated gene frequency is 0.052. CONCLUSIONS We confirmed that previous findings based on hormonal newborn screening appear inaccurate and underestimate the frequency of CAH. We 106 concluded that gene frequency varies significantly in the different populations and cannot be extrapolated from data in some population groups. The findings of our study can be applied i) to create a data base for establishing a neonatal screening program in the Greek population, ii) to orientate the molecular analysis of a patient, iii) to early recognize of the affected fetus during prenatal control, a finding needed for preventing virilization of the female fetus, and iv) to detect heterozygotes in the general population, a prerequisite for genetic counseling.

Η διαταραχή της στεροειδογένεσης που προκαλείται από μεταλλάξεις του γονιδίου της 21-υδροξυλάσης (CYP21A2), αποτελεί το συχνότερο αίτιο της Συγγενούς Υπερπλασίας Επινεφριδίων (ΣΥΕ). Δεδομένα για τη συχνότητα του γονιδίου, βασισμένα σε μοριακές τεχνικές, είναι ελάχιστα. ΣΚΟΠΟΣ Σκοπός της μελέτης ήταν η αναζήτηση του είδους και της συχνότητας των διαταραχών του γονιδίου CYP21A2 στον Ελληνικό πληθυσμό. ΥΛΙΚΟ-ΜΕΘΟΔΟΙ Δείγματα αίματος νεογνών ελήφθησαν από μαιευτήρια όλης της χώρας κατά το χρονικό διάστημα 2002-2004. Η ανάλυση του DNA έγινε σε 454 δείγματα (908 αλληλόμορφα). Η μέθοδος του εκλεκτικού πολλαπλασιασμού τμήματος συγκεκριμένου αλληλομόρφου (Allele specific PCR) εφαρμόσθηκε για την ανίχνευση 12 μοριακών διαταραχών του γονιδίου CYP21Α2: Ομόζυγος απάλειψη/μετατροπή του γονιδίου CYP21Α2, P30L και W22X (εξώνιο 1), I2splice (ιντρόνιο 2), 8bpdelE3 (εξώνιο 3), I172N (εξώνιο 4), ClusterE6 (εξώνιο 6), V281L και F306+T (εξώνιο 7), Q318X και R356W (εξώνιο 8), P453S (εξώνιο 10) και δύο πολυμορφισμών ( K102R, S268T ). Οι μεταλλάξεις που μελετήθηκαν, αντιστοιχούν στο 97% των διαταραχών του γονιδίου CYP21Α2 σε πληθυσμό Ελλήνων πασχόντων, σύμφωνα με προηγούμενη μελέτη μας. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Ανιχνεύθηκαν μεταλλάξεις σε 47 αλληλόμορφα (5.2%): 15 της κλασσικής μορφής της νόσου (Q318X,1.2%; I172N,0.22%; I2splice,0.11%, W22X,0.11%) και 32 της μη κλασσικής μορφής (V281L, 2.1%; P453S, 0.99%; P30L, 0.44%). 9.9% των δειγμάτων μας ήταν φορείς των διαταραχών της ανεπάρκειας της 21-υδροξυλάσης. Η συχνότητα των ετεροζυγωτών της κλασσικής μορφής της νόσου είναι 3.1% και της μη κλασσικής μορφής 6.8%. Υπολογίσαμε τη συχνότητα της κλασσικής μορφής ανεπάρκειας της 21- υδροξυλάσης σε 1:3,663 και τη συχνότητα της μη κλασσικής μορφής σε 1:416. Η υπολογισθείσα συχνότητα του γονιδίου είναι 0.052. 104 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ H έρευνά μας επιβεβαίωσε ότι προηγούμενα δεδομένα ελέγχων διαλογής νεογνών (screening), βασισμένα σε ορμονικές εξετάσεις, υποεκτιμούν την συχνότητα της ανεπάρκειας της 21-υδροξυλάσης. Επιπλέον προκύπτει το συμπέρασμα ότι η συχνότητα του γονιδίου ποικίλλει σημαντικά στους διάφορους πληθυσμούς και δεν μπορεί να υπολογιστεί υποθετικά από δεδομένα άλλων πληθυσμιακών ομάδων. Ο καθορισμός του είδους και της συχνότητας των διαφόρων μεταλλάξεων του CYP21Α2 γονιδίου όπως εξετέθησαν, είναι ιδιαίτερα χρήσιμος 1) για την αναζήτηση ετεροζυγωτών της νόσου στο γενικό πληθυσμό και τη χορήγηση γενετικών συμβουλών, 2) για την έγκαιρη αναγνώριση των υπόπτων εμβρύων κατά τον προγεννητικό έλεγχο και 3) στη δημιουργία βάσης δεδομένων για την εφαρμογή προγράμματος screening στον Ελληνικό πληθυσμό