Ανάπτυξη και αξιολόγηση τριχοειδούς οπτικού ανοσοαισθητήρα φθορισμού για τον ταυτόχρονο προσδιορισμό διαφορετικών ουσιών στο ίδιο δείγμα

Abstract

Τhis work deals with the development of a multi-analyte capillary optical immunosensor. The immunosensor was employed for the simultaneous determination of three different pesticides (mesotrione, hexaconazole and pirimicarb) in samples of commercially available bottled natural waters. Τhe immunosensor was based on capillary tubes that served as signal transducers, as the solid-phases for the immobilization of the immunoreagents and as the immunoreaction vials. The reasons that lead to the selection of the capillary geometry for the fabrication of the immunosensor were: i) the expected increase in the reaction rate due to the increased surface to volume ratio and the restricted influence of the diffusion owing to the small internal diameter of the capillary and ii) the reduced consumption of immunoreagents. Plastic material was chosen for the preparation of single use capillaries, due to the simplicity of immunoreagents immobilization it offered and the expected reduction in fabrication costs. Poly-(methyl-pentene) was found to be the most suitable plastic material due to the low auto-fluorescence it presented, compared to other plastic materials tested, and its satisfactory protein adsorption characteristics. Fluorescein was chosen as the most suitable label based on the criterion of higher signal to background ratio that depends on the selected material for the fabrication of the capillaries, the labeling procedure and the fluorescence characteristics of each label. The simultaneous determination of the different analytes was accomplished through the formation of different immunoreaction bands in the internal surface of the capillary that were equal in number with the determined analytes. The formation of these bands was achieved by injecting the appropriate volume of the immunoreagent in pre-determined positions of the capillary, since this methodology provided more symmetrical peaks compared to that based on the successive aspiration of immunoreagents and inert protein, whereas it was also faster and easier. The geometric characteristics of the immunoreaction bands were optimized, so as to achieve the highest possible signal and avoid cross-talk effects. The immunoassay of each pesticide was developed in microtitration wells, so as to serve as comparison method for the results obtained using the triple-band immunosensor developed for the simultaneous determination of all three pesticides. Prior to the development of triple-band immunosensor, each analyte was determined separately by developing the single-band immunosensor. The conditions chosen for the single-band immunosensor were also employed for the triple-band sensor, since it was found that each immunoassay performed in the internal surface of the capillary immunosensor is independent from the rest. Detection limits and working ranges for all three analytes were the same for immunoassays performed either using microtitration wells or single- and triple-band immunosensors. In addition, the performance of recovery and dilution tests proved the accuracy of measurements using single- and triple-band immunosensors. ...............................................................................................

Στα πλαίσια της παρούσας εργασίας αναπτύχθηκε τριχοειδής οπτικός ανοσοαισθητήρας ικανός για τον ταυτόχρονο προσδιορισμό διαφορετικών αναλυτών στο ίδιο δείγμα. Ο ανοσοαισθητήρας αυτός χρησιμοποιήθηκε για τον ταυτόχρονο προσδιορισμό τριών παρασιτοκτόνων (μεσοτριόνη, εξακοναζόλη και πιριμικαρβαμίδη) σε δείγματα εμπορικά διαθέσιμων εμφιαλωμένων νερών. Ο ανοσοαισθητήρας βασίστηκε σε τριχοειδείς σωλήνες οι οποίοι χρησίμευσαν ως μεταλλάκτες σήματος, ως στερεοί φορείς για την ακινητοποίηση των βιομορίων αναγνώρισης αλλά και ως φιαλίδια ανοσοαντίδρασης. Οι λόγοι που οδήγησαν στην επιλογή της τριχοειδούς γεωμετρίας για την κατασκευή του ανοσοαισθητήρα ήταν: ι) η αναμενόμενη αύξηση της ταχύτητας των ανοσοαντιδράσεων εξαιτίας του αυξημένου λόγου δραστικής επιφάνεια προς όγκο δείγματος αλλά και της περιορισμένης επίδρασης της διάχυσης λόγω της μικρής εσωτερικής διαμέτρου του τριχοειδούς και ιι) η ελαττωμένη κατανάλωση αντιδραστηρίων. Για την κατασκευή των τριχοειδών μίας χρήσης, επιλέχθηκε πλαστικό υλικό, τόσο λόγω της ευκολίας ακινητοποίησης των ανοσοαντιδραστηρίων, όσο και του αναμενόμενου ελαττωμένου κόστους παρασκευής. Το πολυ-(μεθυλοπεντένιο) βρέθηκε ότι ήταν το καταλληλότερο πλαστικό εξαιτίας του πολύ χαμηλού αυτοφθορισμού που εμφάνισε σε σχέση με τα υπόλοιπα πλαστικά υλικά που ελέχθησαν, αλλά και της ικανοποιητικής προσρόφησης πρωτεϊνών που παρείχε. Η φλουορεσκεΐνη επιλέχθηκε ως ο καταλληλότερος ιχνηθέτης με βάση το κριτήριο του μεγαλύτερου λόγου ειδικού σήματος προς σήμα υποβάθρου, το οποίο εξαρτάται από το επιλεχθέν υλικό κατασκευής των τριχοειδών, από την διαδικασία επισήμανσης αλλά και τα χαρακτηριστικά φθορισμού κάθε ιχνηθέτη. Ο ταυτόχρονος προσδιορισμός των διαφορετικών παρασιτοκτόνων επιτεύχθηκε με την κατασκευή διαφορετικών βιοδραστικών ζωνών στο εσωτερικό του τριχοειδούς, οι οποίες ήταν ίσες σε αριθμό με τους προσδιοριζόμενους αναλύτες. Η κατασκευή των ζωνών αυτών πραγματοποιήθηκε με εναπόθεση του κατάλληλου όγκου από την προς ακινητοποίηση ουσία σε προκαθορισμένες θέσεις του τριχοειδούς, καθώς αυτή η μεθοδολογία παρείχε συμμετρικότερες κορυφές σε σχέση με αυτή των διαδοχικών αναρροφήσεων ανοσοαντιδραστηρίου και αδρανούς πρωτεΐνης, ενώ επιπλέον ήταν ταχύτερη και απλούστερη. Τα γεωμετρικά χαρακτηριστικά των βιοδραστικών ζωνών βελτιστοποιήθηκαν ώστε το λαμβανόμενο σήμα από κάθε ζώνη να είναι το μέγιστο δυνατό, χωρίς την εμφάνιση φαινομένων συναπόκρισης. Ο ανοσοπροσδιορισμός καθενός από τα παρασιτοκτόνα ξεχωριστά αναπτύχθηκε αρχικά σε φρεάτια μικροτιτλοδότησης, με σκοπό να αποτελέσει μέθοδο σύγκρισης των αποτελεσμάτων που λαμβάνονται με τον ανοσοαισθητήρα τριπλής ζώνης που αναπτύχθηκε για τον ταυτόχρονο προσδιορισμό των τριών παρασιτοκτόνων. ......................................................