Ανάλυση δομής-λειτουργίας γλουταμικής αφυδρογονάσης ειδικής για το νευρικό σύστημα και γενετική προδιάθεση νόσου Πάρκινσον

Abstract

Glutamate dehydrogenase (GDH) catalyzes the oxidative de-amination of glutamate to aketoglutarate and ammonia. In the human exists in hGDHl and hGDH2 isoforms, differing in their regulation and tissue expression pattern. Early studies have shown that a rare variant in GLUD2 that is expressed in brain interacted significantly with age at PD onset. The purpose of this thesis was to study further the molecular mechanisms regulating hGDH2 function by creating and analyzing hGDH2 mutants harboring single amino acid substitutions in the regulatory domain of the protein. Furthermore, we sought to investigate whether there are differences in the interaction of steroid hormones with hGDHl and hGDH2. Finally, we searched for disease-predisposing alleles in PD by studying the GLUD2 gene in a larger PD patient cohort. In this direction, the following experimental procedures were used: - Site-directed mutagenesis of the GLUD1 and the GLUD2 genes. - Production of mutated GDH proteins expressed in S£21 cells (using the baculovirus expression system) and purification using hydrophobic interaction and hydroxyapatite chromatography. - Enzyme assays and regulation studies of the enzymes in the direction of reductive aminati on of x-ketoglutarate. - Mutation screening and genotypic analysis to determine the presence of any variations within the GLUD2 gene. In order to understand the molecular mechanism of hGDH2 five mutants were obtained: three with an amino acid change (Glu441Arg, Ser445Leu and Ser448Pro) in the antenna and two (Lys450Glu, His454Tyr) in the pivot helix. Functional analyses revealed that, while the antenna mutations increased basal enzyme activity without affecting its allosteric properties, the pivot helix mutations drastically reduced basal activity and impaired enzyme regulation. Structure/function hGDHs analyses revealed that the evolutionary Arg443Ser substitution, which confers low basal activity, was largely responsible for sensitivity of hGDH2 to estrogens. Moreover, inhibition of both human GDHs by estrogens was inversely related to their state of activation induced by ADP, with the slope of this correlation being steeper for hGDH2 than for hGDHl. The study of the GLUD2 gene in Cretan PD patients for disease predisposing alleles revealed that hemizygous for the Ser445Ala rare polymorphism developed PD 8 to 13 years earlier than PD patients with other genotypes. These findings were replicated in two other independent PD cohorts from Central Greece and Northern America. The present study provides a substantial insight into the molecular mechanisms and regulation of hGDHs. Furthermore, since estrogens act as specific inhibitors of hGDH2, they may play a significant role in the development of novel therapeutic approaches to human degenerative disorders in the future.

Η γλουταμική αφυδρογονάση (GDH) καταλύει την ανάστροφη οξειδωτική απαμίνωση του L-γλουταμικού οξέως, που αποτελεί τον κύριο διεγερτικό νευροδιαβιβαστή. Στον άνθρωπο υπάρχουν δυο ισόμορφες οι οποίες παρουσιάζουν μεγάλες λειτουργικές διαφορές, ως προς την βασική τους δραστηριότητα και την ρύθμιση τους από αλλοστερικούς τροποποιητές. Παράλληλα, μελέτες για πιθανή δυσλειτουργία της GDH σε ασθενείς με νευροεκφυλιστικά νοσήματα έδειξαν ότι μετάλλαξη στο γονίδιο της hGDH2, σχετίζεται με πρώιμη έναρξη της νόσου Πάρκινσον. Στόχοι της παρούσας διατριβής ήταν η μεταλλαξιογένεση επιλεγμένων αμινοξέων της ρυθμιστικής περιοχής της hGDH2 πρωτείνης και η μελέτη των μεταλλαγμένων πρωτεϊνών, ώστε να κατανοηθεί η μοριακή βάση ρύθμισης της βασικής δραστηριότητας του ενζύμου. Παράλληλα, μελετήθηκε η ευαισθησίας τους σε αλλοστερικούς τροποποιητές, όπως τα οιστρογόνα. Τέλος, ολοκληρώθηκε η ανάλυση επιπλέον ασθενών με νόσο του Πάρκινσον και ισάριθμο δείγμα υγιών δεικτών για να καθοριστεί εάν η Ala445Ser μετάλλαξη είναι ειδική για την νόσο, ενώ αναζητήθηκαν πιθανοί άλλοι πολυμορφισμοί στο γονίδιο της GLUD2 που να σχετίζονται με την νόσο. Για τον σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν οι παρακάτω τεχνικές: - Μεταλλαξιογένεση του cDNA της GLUD για την πρόκληση σημειακών μεταλλάξεων στο μόριο της GDH. - Παραγωγή ανασυνδυασμένων GDH πρωτεϊνών χρησιμοποιώντας το σύστημα baculovirus σε σειρές Sf21 κυττάρων, και καθαρισμός των πρωτεϊνών με υγρή χρωματογραφία στήλης υδροφοβικής αλληλεπίδρασης. - Μελέτη λειτουργικών ιδιοτήτων των αγρίου τύπου και μεταλλαγμένων GDH (αναστολή από GTP, ενεργοποίηση από L-leucine και ADP, αναστολή από οιστρογόνα και αντιψυχωσικά). - Γενετική ανάλυση μεταλλάξεων στο γονίδιο GL UD2 σε DNA ασθενών με νόσο του Πάρκινσον και υγιών δεικτών. Για να κατανοηθεί η μοριακή βάση ρύθμισης της βασικής δραστηριότητας της hGDH2, οι μεταλλάξεις Gln441Arg, Ser445Leu, Ser448Pro, Lys450Glu, His454Tyr στη hGDH2 εκφράστηκαν και μελετήθηκαν σε σύγκριση με τον άγριο τύπο hGDH2. Τα αποτελέσματα της έρευνας αυτής έδειξαν πως δυο μεταλλάξεις της 'αντένας' (Glu441Arg, Ser445Leu) παρουσίασαν υψηλότερη βασική δραστηριότητα διατηρώντας τον αλλοστερικό τους χαρακτήρα. Αντίθετα, οι μεταλλάξεις της 'pivot helix' (Lys450Glu, His454Tyr) ελαχιστοποίησαν την βασική τους δραστηριότητα. Η ανάλυση της ευαισθησίας των αγρίου τύπου ενζύμων, καθώς και των μεταλλαγμένων μορφών τους στα οιστρογόνα, έδειξε πως η αλλαγή Arg443Ser προσδίδει την ευαισθησία της hGDH2 στους αλλοστερικούς τροποποιητές. Παράλληλα βρέθηκε πως η αλληλεπίδραση των στεροειδών με τις γλουταμικές αφυδρογονάσες σχετίζεται αντίστροφα με το επίπεδο ενεργοποίησης τους. Η μελέτη μεγαλύτερου δείγματος Παρκινσονικών ασθενών με ενζημική πέψη με ενδονουκλεάση περιορισμού και με ταυτοποίηση αλληλουχίας όλου το γονιδίου επιβεβαίωσε ότι η αλλαγή Ser445Ala όταν βρίσκεται σε ημίζυγη μορφή στους άνδρες σχετίζεται με την πρώιμη έναρξη της νόσου. Τα αποτελέσματα αυτά αναπαράχθηκαν και σε δείγματα ασθενών από την Κεντρική Ελλάδα και την Βόρεια Αμερική. Η παρούσα διατριβή συμβάλλει στην κατανόηση των σχέσεων μεταξύ αλληλουχίας-δομής και λειτουργίας του ενζύμου της γλουταμικής αφυδρογονάσης. Επιπροσθέτως, τα οιστρογόνα, με βάση την ιδιότητα που έχουν να δρουν ως ειδικοί αναστολείς της hGDH2, μπορεί να αποτελέσουν στο μέλλον το μέσο για την δημιουργία νέων θεραπευτικών αγωγών για ασθένειες που σχετίζονται με πρώιμη γήρανση και υπερέκφραση της hGDH2.