Βιοτεχνολογική αξιολόγηση των εστερασών του φερουλικού οξέος ως εργαλείων σύνθεσης βιολογικά ενεργών ενώσεων

Abstract

The present PhD thesis focuses on the biotechnological evaluation of feruloyl esterases (E.C. 3.1.1.73), a class of hydrolytic enzymes, and particularly on their synthetic ability to modify hydroxy-cinnamic acids. Hydroxy-cinnamic acids belong to the family of phenolic acids and are biologically active compounds with antioxidant, antimicrobial, photoprotective, antiviral, anti-inflammatory and anticancer activity. They were modified via esterification and transesterification reactions in non conventional media (mixtures of organic solvents, ionic liquids), which are used in biocatalytic processes in order to enhance the substrates’ solubility and reverse the thermodynamic equilibrium from the hydrolysis towards the synthesis of an ester bond. The enzymatic modification of hydroxy-cinnamic acids was performed via esterification with hydrophilic compounds (mono- and oligo-saccharides, glycerol) and lipopholic compounds (aliphatic alcohols). At first, the synthetic activity of two type C feruloyl esterases was investigated (StFaeC from the fungus Sporotrichum thermophile and TsFaeC from the fungus Talaromyces stipitatus), using as reaction systems detergentless microemulsions. In these media, transesterification reactions between methyl esters of hydroxyl-cinnamic acids and mono- and oligo-saccharides were studied. The produced esterified sugars were proved to possess antimicrobial activity against the in vitro growth of mycobacterium, responsible for the tuberculosis desease. Subsequently, the detergentless microemulsions were employed as reaction media for the enzymatic lipophilisation of hydroxy-cinnamic acids and particularly for the synthesis of their butyl esters. In that case, a type A feruloyl esterase from the fungus Aspergillus niger (AnFaeA) and three commercial enzyme preparations, containing feruloyl esterase activity, were used as biocatalysts. Both free and immobilised enzymes were used. In order to immobilise them, the preparation of cross-linked enzyme aggregates (CLEAs) methodology was employed. This is the first example of immobilisation of feruloyl esterases until present. The synthesised butyl esters of hydroxy-cinnamic acids presented antioxidant activity against the inhibition of the oxidation of low-density lipoprotein (LDL) in vitro. In order to expand the synthetic activity of feruloyl esterases in other non conventional media, their activity in ionic liquids was investigated. Ionic liquids, which are salts usually in liquid form in ambient temperatures, are a new and very promising category of solvents with many advantages against conventional organic solvents and with potentiality to design their properties (designer solvents). In these media, the enzymatic esterification of glycerol with sinapic acid was succeeded using the type A feruloyl esterase AnFaeA in its free and immobilised form. The modification of glycerol, which is a biodiesel industry by-product, shows increasing interest in a wide spectrum of applications (food, pharmaceutical and cosmetic industry). This reaction is the first example reported for the activity of feruloyl esterases in ionic liquids, expanding their use in these new reaction systems

Η παρούσα διδακτορική διατριβή έχει ως αντικείμενο τη βιοτεχνολογική αξιολόγηση μίας κατηγορίας ενζύμων, των εστερασών του φερουλικού οξέος (E.C. 3.1.1.73), ως προς τη συνθετική τους ικανότητα με στόχο την τροποποίηση των υδροξυ-κινναμικών οξέων. Τα υδροξυ-κινναμικά οξέα ανήκουν στην οικογένεια των φαινολικών οξέων, που αποτελούν βιολογικά ενεργές φυσικές ουσίες Η τροποποίηση τους πραγματοποιήθηκε μέσω ενζυμικών αντιδράσεων εστεροποίησης σε μη συμβατικά συστήματα (μίγματα οργανικών διαλυτών, ιοντικά υγρά), μέσα που αυξάνουν τη διαλυτότητα των υποστρωμάτων και μετατοπίζουν τη θερμοδυναμική ισορροπία της αντίδρασης από την υδρόλυση προς τη σύνθεση εστερικού δεσμού. Tα υδροξυ-κινναμικών οξέων τροποποιήθηκαν μέσω εστεροποίησης με υδρόφιλα μόρια (μονο- και ολιγο-σακχαρίτες, γλυκερόλη) και με λιπόφιλα μόρια (αλειφατικές αλκοόλες). Αρχικά, μελετήθηκε η συνθετική δράση δύο εστερασών του φερουλικού οξέος τύπου C (StFaeC του μύκητα Sporotrichum thermophile και η TsFaeC του μύκητα Talaromyces stipitatus), χρησιμοποιώντας ως μέσα αντιδράσεων μικρογαλακτώματα απουσία επιφανειοενεργών ουσιών. Στα συστήματα αυτά, μελετήθηκαν αντιδράσεις μετεστεροποίησης μεταξύ μεθυλεστέρων των υδροξυ-κινναμικών οξέων με μονο- και ολιγο-σακχαρίτες. Τα προκύπτοντα εστεροποιημένα σάκχαρα αποδείχθηκαν ουσίες με αντιμικροβιακή δράση έναντι της in vitro ανάπτυξης μυκοβακτηρίων που ευθύνονται για τη νόσο της φυματίωσης. Στη συνέχεια, τα προαναφερθέντα μικρογαλακτώματα χρησιμοποιήθηκαν ως μέσα αντίδρασης για την ενζυμική λιποφιλίωση των υδροξυ-κινναμικών οξέων και συγκεκριμένα, τη σύνθεση βουτυλεστέρων τους. Ως βιοκαταλύτες χρησιμοποιήθηκαν μία τύπου Α εστεράση του φερουλικού οξέος, η AnFaeA του μύκητα Aspergillus niger, καθώς και τρία εμπορικά ενζυμικά σκευάσματα με ενεργότητα εστεράσης του φερουλικού οξέος. Οι βιοκαταλύτες αυτοί χρησιμοποιήθηκαν τόσο στην ελεύθερη όσο και στην ακινητοποιημένη τους μορφή. Για την ακινητοποίησή τους, χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος σχηματισμού ενζυμικών συσσωματωμάτων διασταυρούμενων δεσμών (Cross-linked enzyme aggregates, CLEAs). Αυτό αποτελεί και το πρώτο παράδειγμα ακινητοποίησης εστερασών του φερουλικού οξέος στη βιβλιογραφία. Οι βουτυλεστέρες των υδροξυ-κινναμικών οξέων που παρασκευάστηκαν παρουσίασαν αντιοξειδωτική δράση ως προς την παρεμπόδιση της οξείδωσης της χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνης (LDL) in vitro. Mε στόχο τη διεύρυνση της συνθετικής ικανότητας των εστερασών του φερουλικού οξέος σε άλλα μη συμβατικά συστήματα, ερευνήθηκε η δράση τους σε ιοντικά υγρά, τα οποία είναι άλατα σε υγρή ως επί το πλείστον μορφή σε θερμοκρασίες περιβάλλοντος. Αποτελούν μία νέα και πολλά υποσχόμενη κατηγορία διαλυτών λόγω των πλεονεκτημάτων τους έναντι των κλασσικών οργανικών διαλυτών, αλλά και της δυνατότητας σχεδιασμού των ιδιοτήτων τους ανάλογα με την εκάστοτε διεργασία (designer solvents). Στα συστήματα αυτά πραγματοποιήθηκε επιτυχώς η ενζυμική εστεροποίηση της γλυκερόλης με σιναπικό οξύ με τη δράση της εστεράσης του φερουλικού οξέος AnFaeA, στην ελεύθερη και ακινητοποιημένη της μορφή. Η τροποποίηση της γλυκερόλης, που είναι παραπροϊόν της βιομηχανίας biodiesel, παρουσιάζει αυξανόμενο ενδιαφέρον σε ένα ευρύ πεδίο εφαρμογών (βιομηχανία τροφίμων, καλλυντικών, φαρμάκων κ.ά). Η αντίδραση αυτή αποτελεί το πρώτο παράδειγμα δράσης εστερασών του φερουλικού οξέος σε ιοντικά υγρά, επεκτείνοντας τις χρήσεις των ενζύμων αυτών σε νέα συστήματα αντιδράσεων.