Μελέτη της in vitro ωρίμανσης ωαρίων και της αρχικής ανάπτυξης εμβρύων επίμυων, υπό την επίδραση αυξητικών παραγόντων και ορμονών στα καλλιεργητικά μέσα

Abstract

Even though gonadotrophins play an important role on fullicogenesis, it seems that they do not suffice to initiate and complete the growing process. A number of factors may act synergically with gonadotrophins to trigger the initiation of follicular growth and to modulate early follicular development. Retinoblastoma protein modulates the primary stages of cell differentiation, and its concentration in human follicles peaks before antrum formation. C-kit, a tyrosine kinase receptor, is expressed in oocytes, and its ligand, stem cell factor, in the granulose cells both in the mouse and in the human. Oocytes in the mice lacking the c-kit-stem-cell factor pathway fail to develop beyond primordial stage. Growth differentiation factor-9 (GDF-9) is a member of the TGFβ (transforming growth factor β family and has been found to be expressed in the oocytes of mice, cows, sheep, rats, and humans. Synthesis of GDF-9 begins in oocytes in the primary follicles and continues throughout oogenesis. Fulliculogenesis is blocked at the primary stage in GDF-9 null mice. Studies in humans have shown the presence of insulin-like growth factor receptor (IGF-1-R) in follicles from primordial to preovulatory stage. Insulin-like growth factor-1 alone or in combination with FSH stimulates the proliferation of granulose cells both in the immature as in the mature follicles. Growth hormone (GH) accelerates the actions of gonadotrophins at the ovary so it has been characterized as syngonadotrophin. Epidermal growth factor (EGF) and transforming growth factor (TGF), as well as their common receptor, have been immunohistochemically detected in human follicular tissues. Many studies have shown that EGF induces cumulus cells’ expansion and GV break down (GVBD). Prolactin, a hormone with at least 300 biological functions, modulates a variety of physiological processes. Prolactin is produced by numerous cells and tissues. In addition to the anterior pituitary gland, PRL gene expression has been confirmed in the brain, myometrium, ovary, thymus, spleen, mammary epithelial cells and tumors. Prolactin seems to play an important role in reproduction. Female mice homozygous (-/-) for a disruption of PRL receptor gene exhibit reduced ovulation, abnormal cycles, and fertilization defects. Their oocytes fail to resume meiosis. Prolactin increases the rate of GVBD when added in immature mouse follicles cultures. These mice have disturbed luteal function and their corpus luteum cells show increased apoptosis. Oocyte maturation is a long and enigmatic process during which, nuclear and cytoplasmic changes happen, resulting in transition from GV stage to the metaphase II stage and the extrusion of the first polar body. During oocyte maturation several products are synthesized and stored. These products support embryonic development until embryonic genome become capable to support embryogenesis. Cumulus cells also contribute to substance production during oocyte maturation. They secrete products in response to gonadotrophins that control nuclear and cytoplasmic maturation. To investigate the role of growth factors and hormones, such as GH, o IGF- 1 and PRL in in vitro oocyte nuclear maturation, as well as in fertilization and blastocyst embryonic development we performed short term cultures (18h) of GV stage mouse oocytes and long term cultures (14 days) of early preantral mouse follicles. The rate of nuclear maturation was evaluated as the percentage of oocytes with the first polar body (PB) to the total number of GV stage oocytes and COCs respectively. Fertilization was assessed 24 h later by the presence of the 2-cell embryos. Embryonic development was assessed as the presence of morulae (fourth day after fertilization) and blastocysts (fifth day after fertilization). We found that growth factors and hormones we have used in short term cultures resulted in statistically significant higher nuclear maturation rate as percentage of PB compare to the control cultures. Some of the hormones combinations added in the culture media showed similar results. This observation supports the possibility the GH, IGF-1 and PRL are implicated in maturation of immature oocytes in vitro and ovulation. As long as it concerns in long duration cultures, PRL in certain concentrations resulted in significantly higher nuclear maturation, fertilization and early embryonic development rate compare to the cultures without PRL. These results extent the possibility the PRL is implicated in the process of oocyte maturation, in the resumption of the 1st meiotic division, in the ovulation and in the early embryonic development in the mouse. Furthermore, in order to assess the extent to which prolactin is implicated in the process of reproduction and early embryo development in mice, we examined the expression of PRL-R mRNA transcripts using reverse transcriptase polymerase chain reaction in mice cumulus cells, preantral follicles, cumulus oocyte complexes-COCs, nude oocytes in metaphase 1 (GV stage), in metaphase II (polar body), as well as in the embryonic stages of zygote, two cells, four cells, morula and blastocyst. Reverse transcription was followed by bracket-nested PCR for PRL-R mRNA. The RT-PCR products were verified by restriction enzyme analysis. The expected RT-PCR products, contained fragments for PRL-RL detected by agarose gel electrophoresis in all stages examined, while transcripts for the other isoforms of PRL-R were detected in various stages of follicular and early embryonic development. In conclusion, this study clearly demonstrated that different isoforms of PRL-R are present in the various stages of in vitro matured mouse follicles. Prolactin acts on its receptor in early preantral follicles, in COCs and in GV stage oocytes resulting to increased nuclear maturation rates. Additionally, fertilization and early embryonic development rates are augmented when preantral follicles are cultured in the presence of PRL. This observation can be helpful in the better understanding of mechanisms that regulate oocyte maturation as well as in the development of new assisted reproduction protocols, even if the improvement of well-established methods in IVF/ICSI remains an issue for extended studies. Furthermore, GH, IGF-1 and PRL act on theirs receptors in GV stage oocytes, in a dose-dependent manner, increasing nuclear maturation rates of the oocytes.

Οι γοναδοτροπίνες διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη διαδικασία της ωρίμασης των ωοθυλακίων. Δεν είναι όμως από μόνες τους ικανές να αρχίσουν και να ολοκληρώσουν τη διαδικασία. Σημαντικός αριθμός ορμονικών και μη παραγόντων ενδέχεται να δρα ανεξάρτητα ή και συνεργικά με τις γοναδοτροπίνες και να ρυθμίζει την ωοθυλακική ανάπτυξη. Η πρωτεΐνη του ρετινοβλαστόματος ρυθμίζει τα αρχικά στάδια της διαφοροποίησης των κυττάρων και η συγκέντρωσή της κορυφώνεται στα ανθρώπινα ωοθυλάκια πριν τον σχηματισμό του άντρου. Ο C-kit είναι διαμεμβρανικός υποδοχέας με δράση τυροσινικής κινάσης που εκφράζεται στα ωάρια και ο συνδέτης του (stem cell factor) εκφράζεται στα κοκκώδη κύτταρα τόσο αρουραίων όσο και ανθρώπων. Ωάρια επίμυων με απώλεια του c-kit-stem cell factor συστήματος αδυνατούν να αναπτυχθούν περαιτέρω του σταδίου του αρχέγονου ωοθυλακίου. Ο αυξητικός παράγοντας διαφοροποίησης-9 (growth differentiation factor-9, GDF-9) ανήκει στην οικογένεια TGFβ (μετατρεπτικός αυξητικός παράγοντας, transforming growth factor β) και έχει βρεθεί ότι εκφράζεται στα ωάρια επίμυων, βοοειδών, αμνών, αρουραίων και ανθρώπων. Η σύνθεση του mRNA του GDF-9 αρχίζει σε ωάρια πρωτογενών ωοθυλακίων και συνεχίζεται σε όλη τη διάρκεια της ωοθυλακικής ανάπτυξης. Μελέτες σε ανθρώπους έχουν δείξει την ύπαρξη του υποδοχέα του IGF-1 σε ωοθυλάκια από το στάδιο του αρχέγονου έως και το γραφιανό (Zhou and Bondy 1993a). Ο παρόμοιος με την ινσουλίνη αυξητικός παράγοντας I (IGF-1) μόνος του αλλά και σε συνέργεια με την ωοθυλακιοτρόπο ορμόνη (FSH) διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των κοκκωδών κυττάρων ανώριμων και ώριμων ωοθυλακίων. Η αυξητική ορμόνη (GH) αυξάνει τις δράσεις των γοναδοτροπινών στο επίπεδο της ωοθήκης και έχει χαρακτηριστεί ως συν-γοναδοτροπίνη. Ο επιδερμικός αυξητικός παράγοντας (EGF) και ο μετατρεπτικός αυξητικός παράγοντας α (TGFα) είναι πολυπεπτίδια που έχουν εντοπιστεί, όπως και ο κοινός τους υποδοχέας, με ανοσοϊστοχημικές μεθόδους σε ωάρια που περιέχονται σε πρωτογενή ωοθυλάκια, καθώς και σε κοκκώδη κύτταρα ωοθυλακίων διαφόρων σταδίων ωρίμασης. Σημαντικός αριθμός εργασιών με προσθήκη EGF σε καλλιέργειες ωοθυλακικών συμπλεγμάτων πριν την ωοθυλακιορρηξία (Cumulus Oocyte Complexes-COCs) σε επίμυες, καθώς και σε ωοθυλάκια αρουραίων έδειξαν ότι ο EGF έχει σημαντικό ρόλο στη διάχυση των κοκκωδών κυττάρων (cumulus expansion) καθώς και στην επανέναρξη της μείωσης (GV break down-GVBD). Η προλακτίνη (PRL) είναι μια ορμόνη με τουλάχιστον 300 βιολογικές δράσεις και ρυθμίζει ποικιλία φυσιολογικών διαδικασιών. Έχει περισσότερες δράσεις από ό,τι όλες οι άλλες ορμόνες της πρόσθιας υπόφυσης από την οποία και εκκρίνεται. Η PRL εκτός από την πρόσθια υπόφυση παράγεται σε μεγάλο αριθμό ιστών και κυττάρων. Η έκφραση του γονιδίου της PRL έχει επιβεβαιωθεί στον εγκέφαλο, στο μυομήτριο, στην ωοθήκη, στο θύμο, στο σπλήνα, στα κυκλοφορούντα λεμφοκύτταρα και στα κύτταρα του μυελού των οστών, στα κύτταρα του μαζικού αδένα καθώς και σε όγκους μαστού, στο δέρμα, στους ιδρωτοποιούς αδένες και αλλού. Η PRL φαίνεται ότι παίζει σημαντικό ρόλο στην αναπαραγωγική διαδικασία. Ομόζυγοι (-/-) θηλυκοί επίμυες με απάλειψη του γονιδίου του υποδοχέα της PRL (knockout mice) εμφανίζουν διαταραγμένους κύκλους και μειωμένο αριθμό ωοθυλακιορρηξιών. Η ικανότητα αναπαραγωγής των καλέστε ματαιώστε επίμυων αυτών είναι μειωμένη, έχουν διαταραγμένη ωχρινική λειτουργία με αυξημένη απόπτωση των ωχρινικών κυττάρων. Η PRL βρέθηκε ότι αυξάνει το ποσοστό του GVBD in vitro ανώριμων ωαρίων ποντικών, όταν προστεθεί σε καλλιέργειες ωαρίων. Η ωρίμαση των ωαρίων είναι μία μακρά και πολύπλοκη διαδικασία κατά τη διάρκεια της οποίας πραγματοποιούνται αλλαγές στον πυρήνα και στο κυτταρόπλασμα του ωαρίου οι οποίες οδηγούν στη μετάβαση του ωαρίου από το στάδιο της πρόφασης I ή βλαστικού κυστιδίου (GV stage) στη μετάφαση II και στην εμφάνιση του πρώτου πολικού σωματίου. Κατά τη διάρκεια της ωρίμασης του ωαρίου συντίθενται και αποθηκεύονται διάφορα προϊόντα τα οποία θα υποστηρίξουν την πρώιμη εμβρυϊκή ανάπτυξη. Τα κοκκώδη κύτταρα (cumulus) επίσης συμμετέχουν στην παραγωγή ουσιών σε απάντηση στις γοναδοτροπίνες οι οποίες ρυθμίζουν την πυρηνική και κυτταροπλασματική ωρίμαση. Προκειμένου να διερευνηθεί ο ρόλος των αυξητικών παραγόντων και ορμονών, όπως η GH, ο IGF-1 και η PRL, στην in vitro ωρίμαση ωαρίων, στη γονιμοποίηση και πρώιμη ανάπτυξη εμβρύων επίμυων, διενεργήθηκαν βραχείας διάρκειας (18 ωρών) και μακράς διάρκειας (14 ημερών) καλλιέργειες ωαρίων και ωοθυλακίων επίμυων. Η επίδραση των παραγόντων που χρησιμοποιήθηκαν στην in vitro ωρίμαση των ωαρίων αξιολογήθηκε από το ποσοστό εμφάνισης πρώτου πολικού σωματίου στα ωάρια που καλλιεργήθηκαν σε σχέση με το συνολικό αριθμό των ωαρίων σταδίου GV και COCs αντίστοιχα. Η γονιμοποίηση εκτιμήθηκε 24 h αργότερα από το ποσοστό εμβρύων 2 κυττάρων σε σχέση με τον αριθμό των COCs που επωάστηκαν με το σπέρμα, ενώ η πρώιμη εμβρυϊκή ανάπτυξη από το ποσοστό των βλαστοκύστεων σε σχέση με τον αριθμό των εμβρύων 2 κυττάρων. Βρέθηκε, όσο αφορά στις βραχείας διάρκειας καλλιέργειες, ότι οι παράγοντες που χρησιμοποιήθηκαν, αυξάνουν στατιστικώς σημαντικά σε σχέση με τις καλλιέργειες ελέγχου, το ποσοστό της πυρηνικής ωρίμασης των GV ωαρίων, όπως επίσης και κάποιοι από τους συνδυασμούς ορμονών που προστέθηκαν στο καλλιεργητικό μέσο. Η παρατήρηση αυτή ενισχύει την πιθανότητα εμπλοκής των τριών ορμονών που χρησιμοποιήθηκαν στα τελικά στάδια της ανάπτυξης του ωαρίου και την ωοθυλακιορρηξία. Όσο αφορά τις μακράς διάρκειας καλλιέργειες, που έγιναν για να διαπιστωθεί το εύρος εμπλοκής της PRL στην in vitro ωρίμαση ανώριμων ωαρίων επίμυων, φάνηκε ότι η PRL σε συγκεκριμένες συγκεντρώσεις αυξάνει στατιστικώς σημαντικά το ποσοστό ωρίμασης των ωοθυλακίων πριν το σχηματισμό του άντρου, όπως επίσης το ποσοστό γονιμοποίησης και πρώιμης εμβρυϊκής ανάπτυξης. Τα δεδομένα αυτά ενισχύουν την πιθανότητα εμπλοκής της PRL στην διαδικασία της πυρηνικής ωρίμασης ωαρίων επίμυων, στην επανέναρξη της 1ης μειωτικής διαίρεσής τους, στην ωοθυλακιορρηξία και στην πρώιμη εμβρυϊκή ανάπτυξη. Επιπλέον, για να κατανοήσουμε το ρόλο της PRL στη διαδικασία της αναπαραγωγής και ιδιαίτερα στην ωρίμαση ωαρίων επιμύων, τη γονιμοποίηση και την πρώιμη εμβρυϊκή ανάπτυξη μελετήσαμε την παρουσία του mRNA των ισομορφών του υποδοχέα της PRL σε ωοθυλάκια πριν το σχηματισμό του άντρου (preantral), στο ωοθυλακικό σύμπλεγμα πριν την ωοθυλακιορρηξία (cumulus oocyte complex-COC), σε ωάρια πρόφασης I (σταδίου GV), μετάφασης II (με πολικό σωμάτιο), καθώς και σε διάφορα στάδια πρώιμης εμβρυϊκής ανάπτυξης. Για τη μελέτη της έκφρασης των ισομορφών του υποδοχέα της PRL στα διάφορα στάδια της ωρίμασης ωαρίων και πρώιμης ανάπτυξης εμβρύων επίμυων σχεδιάστηκαν ειδικοί εκκινητές, εσωτερικοί και εξωτερικοί, για την πραγματοποίηση των δύο κύκλων της αντίδρασης αλυσιδωτής πολυμεράσης (διπλή, nested PCR), που χρησιμοποιείται όταν το αρχικό ποσό του DNA που θα πολλαπλασιαστεί είναι μικρό. Αντίγραφα της ισομορφής PRL-RL παρατηρήθηκαν σε όλα τα στάδια που εξετάστηκαν, ενώ αντίγραφα των άλλων ισομορφών παρατηρήθηκαν σε διάφορα στάδια ωοθυλακικής και πρώιμης εμβρυϊκής ανάπτυξης. Η επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων των PCR αντιδράσεων που διενεργήθηκαν έγινε με ανάλυση των προϊόντων της δεύτερης PCR αντίδρασης με περιοριστικά ένζυμα. Συμπερασματικά, η PRL δρα επί των υποδοχέων της σε ωοθυλάκια πριν το σχηματισμό του άντρου, COCs και ωάρια σταδίου GV στον επίμυ, αυξάνοντας στατιστικώς σημαντικά τα ποσοστά πυρηνικής ωρίμασης σε σχέση με τις καλλιέργειες χωρίς PRL. Όταν σε καλλιέργειες ωοθυλακίων επίμυων πριν το σχηματισμό του άντρου προστεθεί PRL, αυξάνει στατιστικώς σημαντικά και το ποσοστό γονιμοποίησης των ωαρίων και πρώιμης ανάπτυξης εμβρύων, σε σχέση με το ποσοστό γονιμοποίησης και ανάπτυξης εμβρύων χωρίς PRL. Οι GH, IGF-1 και PRL δρουν επί των υποδοχέων τους σε ωάρια σταδίου GV με δοσοεξαρτώμενο μάλιστα τρόπο, αυξάνοντας σε συγκεκριμένες συγκεντρώσεις τα ποσοστά πυρηνικής ωρίμασης των ωαρίων.