Πρωτεϊνική μηχανική του ενζύμου L-ασπαραγινάση

Abstract

L-asparaginase catalyzes the conversion of L-Asn to L-Asp and ammonia. The L-asparaginases from Erwinia chrysanthemi and E. coli are currently in clinical use as effective drugs for the treatment of haemapoietic diseases such as ALL (Acute Lymphoblastic Leukaemia). Over the years many homologous L-asparaginases have been cloned and characterized in order to find enzymes with less toxic effects, since it has been shown that the enzyme's effectiveness, its pharmacokinetic properties and the various side effects depend on its origin and its purification protocol. The aim of the present work is the development of a production procedure of L-asparaginase in E. coli cells and the creation of modified forms of the enzyme with desired properties. Genomic DNA from Erwinia chrysanthemi and Erwinia carotovora was isolated and used as template in PCR reactions for the amplification of the ORFs of the corresponding L-asparaginases. The resulting PCR amplicons were TOPO ligated into the T7 expression vector pCR®T7/CT-TOPO®. The resulting expression constructs were used to transform competent BL21(DE3) pLysS E. coli cells. The Er. carotovora L-asparaginase (EcaL-Asnase) and the Er. chrysanthemi enzyme (ErL-Asnase) were fully characterized. The main restrictions to the use of L-asparaginase as a therapeutic agent include its premature inactivation and rapid clearance, thus necessitating frequent injections to maintain therapeutic levels. For designing a protease-resistant L-asparaginase from Er. carotovora (EcaL-ASNase) chemical modification with succinimide esters of polyethylene glycol (PEG) and site-directed mutagenesis were employed. The final modified form was found to be protease resistant. With a view to create in vitro variants with desired properties, EcaL-ASNase and ErL-ASNase were subjected to directed evolution using the Staggered extension process (StEP). One-hundred transformants of the generated library were screened for low L-glutaminase activity and high thermal stability at 55°C. Two enzyme variants (L90I, G281S) with low L-glutaminase activity and one (D133V) with high thermostability were identified and selected for further study. For the variants L90I and G281S it was shown that they don't recognize L-glutamine as substrate, and the D133V was found to be highly thermostable. To further investigate the role of the residue at position 133 on enzyme thermostability, saturation mutagenesis at position 133 was carried out. Five enzyme variants were selected and studied. The results indicated that the amino acid residue at position 133 contributes significant to the enzyme's structural stability.

Το ένζυμο L-ασπαραγινάση καταλύει την μετατροπή της L-ασπαραγίνης σε L-ασπαραγινικό οξύ και αμμωνία. Η ενδοφλέβια χορήγηση του ενζύμου που έχει απομονωθεί από τα βακτήρια Erwinia chrysanthemi και Escherichia coli έχει αποδειχθεί πολύ αποτελεσματική στις περισσότερες των περιπτώσεων λεμφοκυτταρικής λευχαιμίας. Η αποτελεσματικότητα του ενζύμου, οι φαρμακοκινητικές ιδιότητες και οι διαφορετικές παρενέργειες που εκδηλώνονται κατά τη θεραπευτική αγωγή έχει βρεθεί ότι εξαρτώνται από την πηγή προέλευσης και την μέθοδο καθαρισμού του. Σκοπός της μελέτης είναι η ανάπτυξη μίας ολοκληρωμένης μεθόδου παραγωγής του ενζύμου L-ασπαραγινάση σε ανασυνδυασμένα κύτταρα E. coli και η δημιουργία τροποποιήσεων στο ένζυμο, ώστε να προκύψουν ανασχεδιασμένες μορφές με επιθυμητές ιδιότητες. Γενωματικό DNA από τα βακτήρια Erwinia carotovora και Erwinia chrysanthemi απομονώθηκε και χρησιμοποιήθηκε σαν μήτρα για την αναπαραγωγή των κωδικών αλληλουχιών του γονιδίου της L-ασπαραγινάσης, οι οποίες κλωνοποιήθηκαν και τα ένζυμα εκφράστηκαν σε κύτταρα E coli BL21(DE3)pLysS. Ακολούθως πραγματοποιήθηκαν μελέτες με στόχο να χαρακτηριστούν τα ετερόλογα παραγόμενα ένζυμα. Επειδή η L-ασπαραγινάση είναι βακτηριακής προέλευσης, όταν χορηγείται στον άνθρωπο αναγνωρίζεται από τις πρωτεάσες του αίματος και πέπτεται. Με στόχο να δημιουργηθεί ανασχεδιασμένη μορφή της EcaL-Asnase με ανθεκτικότητα στη δράση της θρυψίνης, το ένζυμο τροποποιήθηκε χημικά με ηλεκτριναμικούς εστέρες της πολυαιθυλενογλυκόλης και μεταλλάχθηκε με εφαρμογή κατευθυνόμενης μεταλλαξογένεσης. Οι τροποποιημένες μορφές που προέκυψαν μελετήθηκαν και η τελική ανασχεδιασμένη μορφή είχε τα επιθυμητά χαρακτηριστικά. Για τη δημιουργία in vitro εξελικτικά ανασχεδιασμένης μορφής του ενζύμου με επιθυμητές αλλαγές στις ιδιότητες του, πραγματοποιήθηκε κατευθυνόμενος εξελικτικός ανασχεδιασμός του ενζύμου L-ασπαραγινάση με τη διαδικασία της περιορισμένης επιμήκυνσης. Τελικός στόχος ήταν να βρεθούν κλώνοι με μειωμένη συγγένεια και δραστικότητα για το υπόστρωμα L-Gln, καθώς επίσης και κλώνοι με αυξημένη θερμοσταθερότητα. Επιλέχθηκαν δύο κλώνοι με μειωμένη δραστικότητα L-γλουταμινάσης (L90I, G281S) και ένας κλώνος με αυξημένη θερμοσταθερότητα (D133V). Οι μεταλλαγμένες μορφές μελετήθηκαν και τα αποτελέσματα έδειξαν πως οι μορφές L90I και G281S δεν αναγνώριζαν πλέον την L-γλουταμίνη ως υπόστρωμα. Η δε D133V εμφανίστηκε ιδιαίτερα θερμοσταθερή. Προκειμένου να διερευνηθεί περαιτέρω ο ρόλος του καταλοίπου στη θέση 133 όσον αφορά στην αύξηση της θερμοανθεκτικότητας του ενζύμου, πραγματοποιήθηκε μεταλλαξογένεση κορεσμού στη θέση αυτή. Από τη βιβλιοθήκη που προέκυψε επιλέχθηκαν πέντε κλώνοι, των οποίων η μελέτη έδειξε πως η αμινοξική θέση 133 παίζει σημαντικό ρόλο στη σταθερότητα του ενζύμου, αλλά υπάρχουν και άλλα αμινοξικά κατάλοιπα τα οποία συνεισφέρουν στην ιδιότητά του αυτή.