Μελέτη της βιολογίας του πολλαπλού μυελώματος: διερεύνηση κυτταρικών πληθυσμών και η προγνωστική αξιοποίησή τους

Abstract

Multiple myeloma (MM) is a hematologic malignancy characterized by the accumulation of malignant plasma cells in the bone marrow (BM). In addition to genetic aberrations, plasma cells are heavily influenced by the BM microenvironment. Several candidate agents have been identified through the outcome of laboratory research, but their predictive value has shown minimal clinical benefit. This could be due to ex vivo drug testing restrictions, such as the exclusion of the disease microenvironment in the assays performed and the lack of the 3D BM-structure simulation. Thus, the efficacy of new therapeutic agents should not only evaluate their direct effect on myeloma cells but consider the overall microenvironment of the disease. The aim of this PhD thesis was to analyze the microenvironment in MM and to assess the relevant subpopulations that contribute to myeloma cell proliferation. Under the scope of evaluating current research in the field, we investigated existing MM models with clinical implications. Next, we constructed a de novo 3D model, aiming at the assessment of the protective effect of the microenvironment in MM cells following drug administration. Finally, utilizing deep immunophenotyping of BM and peripheral blood (PB) samples, we extended our research to the identification of the clinically and diagnostically most relevant subpopulations. Initially, we set a number of criteria that should be fully fulfilled in order to consider a MM model effective in simulating the BM microenvironment and possibly be utilized in the clinical setting. Eventually, 15 studies were selected which included models using gel scaffolds, solid scaffolds, bioreactors, microfluidics and animal models. After thorough examination and evaluation of the aforementioned models, we proceeded to the selection of gel and solid scaffolds for our experiments. For the set-up of the ex vivo model, we utilized the myeloma cell lines U266 and H929 and bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) from MM patients to simulate the MM microenvironment. Doxorubicin (an anthracycline) and bortezomib (a proteasome inhibitor) were selected as therapeutic agents for testing. Initially, we assessed the culture of MM cell lines, calculated the IC50 values of the therapeutic agents and BM-MSCs were isolated and cultured from BM samples. We further tested and evaluated various viability assessment methods that were available in our lab, namely MTT, flow cytometry, manual optical count and an image recognition algorithm. The image recognition algorithm was developed specifically for the needs of this application and MM cell line counting was performed upon staining with trypan blue. In conclusion, depending on the experimental setup all methods for the assessment of myeloma cell viability can be utilized. Next, we used gel scaffolds for myeloma cell cultures, but due to unexpected hurdles in assessing viability of MM cells in co-cultures (MM cell lines with BM-MSCs), we decided to finally test solid scaffolds. Disk-shaped Poly-lactic acid (PLA) porous scaffolds, with pores ranging from 60 to 120 μΜ were used, placed at the bottom of 96-well plates. Confocal scanning microscopy and electron scanning microscopy were employed for the study of BM-MSC growth and adherence on PLA scaffolds, and it was shown that BM-MSCs can tightly adhere on the scaffold fibers and extend between the pore spaces. Having examined the individual items of the ex vivo model, we combined all elements in an experimental set-up that included coculture of H929 cells with BM-MSCs on PLA scaffolds, under bortezomib treatment. By assessing the viability of H929 cells, we found higher viability rates of MM cells in all scaffolds compared to 2D cultures. Extending our study beyond BM-MSCs, we proceeded to the deep immunophenotyping of the MM microenvironment using flow cytometry for the assessment of the immune profile of 94 MM patients. A wide panel of subpopulations were identified, including B and T lymphocytes and their subpopulations, Tregs, NK cells, and myeloid-derived suppressor cells (MDSCs). Additionally, minimal residual disease (MRD) assessment information was available, since patients’ samples included in this study have been also analyzed for MRD detection according to the EuroFlow next-generation flow cytometry MRD protocol. The detected subpopulations were examined for their possible correlation with disease stages, the cytogenetic profile and patients’ response to induction therapy. Our initial analyses of BM samples across different disease stages (MGUS, smoldering myeloma, MM, plasmacytic leukemia and MM in complete remission) revealed that there are minimal differences of the populations’ distribution. Also, by comparing paired PB and BM samples from the same patients, we found that the PB immune profile is not identical to that of the BM, thus BM samples cannot be substituted by liquid biopsy. Focusing on the diagnostic information of the patients, we found that the immune profile differs between different prognostic groups based on the International Staging System on MM (ISS) and the cytogenetic profile. Next, we investigated the immune profile at diagnosis in relation to response to therapy and found several population correlations, whereas patients achieving MRD negativity harbored a distinct immune signature after therapy. Lastly, our analysis focused on the PB of patients achieving complete response (CR) to therapy. Our results indicated that the relative frequencies of naïve and effector/effector memory CD4+ T cells were associated with MRD negativity. Based on this finding, we generated an algorithm for MRD prediction. By applying this algorithm to an independent cohort of 20 patients, the prediction of MRD status was achieved, with a sensitivity of 86% and a specificity of 85%. Overall, in the context of this PhD thesis, we generated an ex vivo platform which enables the evaluation of a personalized therapy for MM and can be utilized in further studies. Moreover, immune subsets of the disease’s microenvironment were assessed, showing that MM maintains an active microenvironmental profile, which differs across disease stages and prognostic groups by the expression of distinct immune signatures. The immune profiles are of prognostic significance in relation to response to therapy and MRD prediction. Personalized immune profiling of MM patients may positively contribute to the optimization of the selected therapeutic interventions on a personalized basis. Eventually, it may also lead to the improvement of the outcome of MM patients.

Το πολλαπλούν μυέλωμα (ΠΜ) είναι μια αιματολογική κακοήθεια, η οποία χαρακτηρίζεται από συσσώρευση κακοήθων πλασματοκυττάρων στο μυελό των οστών (ΜΟ). Επιπρόσθετα με τις γενετικές ανωμαλίες οι οποίες εμφανίζονται στους κλώνους ΠΜ, τα πλασματοκύτταρα επηρεάζονται και από το μικροπεριβάλλον του καρκίνου. Αρκετές εργαστηριακές μελέτες έχουν καταδείξει υποσχόμενους παράγοντες, που όμως δεν έχουν οδηγήσει σε κλινικό όφελος. Αυτό μπορεί να οφείλεται σε περιορισμούς κατά την ex vivo δοκιμή του φαρμάκου, η οποία πιθανώς να έχει γίνει χωρίς το μικροπεριβάλλον της νόσου, αλλά και την έλλειψη της προσομοίωσης της τρισδιάστατης αρχιτεκτονικής του περιβάλλοντος του ΜΟ. Συνεπώς, ο χαρακτηρισμός της αποτελεσματικότητας των νέων παραγόντων θεραπείας δεν θα πρέπει μόνο να εκτιμά την άμεση επίδρασή τους στα μυελωματικά κύτταρα, αλλά να λαμβάνει υπόψιν και το συνολικό μικροπεριβάλλον της νόσου. Βασικός σκοπός της διδακτορικής διατριβής είναι η μελέτη του μικροπεριβάλλοντος στο ΠΜ και η διερεύνηση των υποπληθυσμών που διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο σε αυτό. Στο πλαίσιο αυτό, αρχικά διερευνήθηκαν τα υπάρχοντα μοντέλα μελέτης στο ΠΜ υπό το πρίσμα της κλινικής αξιοποίησης. Στη συνέχεια, έγινε de novo κατασκευή τρισδιάστατου ex vivo μοντέλου μελέτης με σκοπό τη διερεύνηση της προστατευτικής δράσης του μικροπεριβάλλοντος στα μυελωματικά κύτταρα υπό την επίδραση θεραπευτικών παραγόντων. Τέλος, με ευρεία ανοσοφαινοτύπηση σε δείγματα ΜΟ και περιφερικού αίματος (ΠΑ) ασθενών με ΠΜ, διευρύναμε την αναζήτηση υποπληθυσμών και αναζητήθηκαν συσχετίσεις με τις διαγνωστικές και θεραπευτικές πληροφορίες των ασθενών. Κατά τη διερεύνηση των δημοσιευμένων ex vivo μοντέλων μελέτης τέθηκαν κριτήρια τα οποία πληρούνταν στο σύνολό τους, ώστε το προτεινόμενο μοντέλο να θεωρείται ότι προσομοιάζει το μικροπεριβάλλον της νόσου, αλλά και να δύναται να αξιοποιηθεί κλινικά. Τελικώς επιλέχθηκαν 15 δημοσιεύσεις οι οποίες πληρούσαν όλα τα κριτήρια και περιλάμβαναν μοντέλα με ικριώματα γέλης, μοντέλα στερεών ικριωμάτων, μοντέλα βιοαντιδραστήρα, μοντέλα μικρορευστότητας (microfluidics) και μοντέλα με χρήση πειραματόζωων. Υπό αυτά τα δεδομένα αποφασίσθηκε η δοκιμή ικριωμάτων γέλης και στερεών ικριωμάτων. Για την πειραματική κατασκευή του ex vivo μοντέλου αξιοποιήθηκαν οι μυελωματικές κυτταρικές σειρές U266 και H929, ενώ με χρήση μεσεγχυματικών στρωματικών κυττάρων μυελικής προέλευσης (ΒΜ-MSCs) από ασθενείς με ΠΜ μοντελοποιήθηκε το μικροπεριβάλλον της νόσου. Οι θεραπευτικοί παράγοντες που επιλέχθηκαν ήταν η δοξορουβικίνη (ανθρακυκλίνη) και η βορτεζομίμπη (αναστολέας πρωτεασώματος). Αρχικά μελετήθηκε η ανάπτυξη των μυελωματικών κυτταρικών, η συγκέντρωση ημίσειας αναστολής του κυτταρικού πολλαπλασιασμού (IC50) από τους παράγοντες και έγινε απομόνωση και καλλιέργεια πρωτογενών ΒΜ-MSCs. Στη συνέχεια αξιολογήθηκαν μέθοδοι μέτρησης βιωσιμότητας των μυελωματικών κυττάρων, δηλαδή η μέθοδος ΜΤΤ, η κυτταρομετρία ροής, η οπτική μέτρηση και ο αλγόριθμος αναγνώρισης εικόνας. Ο αλγόριθμος αναγνώρισης εικόνας αναπτύχθηκε ειδικά για αυτή την εφαρμογή και με τη χρήση του καταμετρώνται τα κύτταρα που έχουν χρωσθεί με κυανούν του τρυπανίου. Συμπερασματικά, διαπιστώθηκε ότι ανάλογα με τις πειραματικές συνθήκες όλες οι μέθοδοι εκτίμησης της βιωσιμότητας των μυελωματικών κυττάρων μπορούν να αξιοποιηθούν κατά περίπτωση. Στη συνέχεια, επιχειρήθηκε η κατασκευή καλλιεργειών με χρήση υδρογέλης, αλλά λόγω δυσκολίας στη μέτρηση της βιωσιμότητας των συγκαλλιεργειών στα ικριώματα υδρογέλης, συνεχίσαμε την ανάπτυξη του μοντέλου με στερεά ικριώματα γαλακτικού οξέως (PLA). Τα ικριώματα PLA που χρησιμοποιήθηκαν είχαν δομή πλέγματος με μέγεθος πόρου από 60 έως 120 μΜ και τοποθετήθηκαν σε μικροπλάκες 96 φρεατίων. Mε χρήση συνεστιακής μικροσκοπίας και ηλεκτρονικής μικροσκοπίας σάρωσης διαπιστώθηκε ότι τα BM-MSCs αναπτύσσονται στα ικριώματα, εκτεινόμενα ανάμεσα στις ίνες του πλέγματος, επομένως μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν στο ex vivo μοντέλο. Έχοντας μελετήσει τα επιμέρους στοιχεία, το συνολικό ex vivo μοντέλο που περιλαμβάνει ικριώματα PLA, δοκιμάσθηκε με την κυτταρική σειρά H929 σε συγκαλλιέργεια με BM-MSCs και υπό την επίδραση βορτεζομίμπης, και σε όλους τους τύπους ικριωμάτων διαπιστώθηκε μεγαλύτερη βιωσιμότητα των μυελωματικών κυττάρων συγκριτικά με τη δισδιάστατη μονοκαλλιέργεια. Επεκτείνοντας τη μελέτη μας πέραν των μεσεγχυματικών κυττάρων, προχωρήσαμε σε ευρεία ανοσοφαινοτύπηση του μικροπεριβάλλοντος χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. Εξετάσθηκε διεξοδικά το ανοσολογικό προφίλ 94 ασθενών με ΠΜ, διερευνώντας κυτταρικούς υποπληθυσμούς μεταξύ των οποίων τα Β και Τ λεμφοκύτταρα και τους υποπληθυσμούς τους, τα Tregs, τα ΝΚ κύτταρα, και τα κατασταλτικά κύτταρα μυελικής προέλευσης (MDSCs). Ταυτόχρονα, αξιοποιήθηκε η πληροφορία για την ύπαρξη ελάχιστης υπολειμματικής νόσου (ΕΥΝ), καθότι οι ασθενείς που συμπεριελήφθησαν στη μελέτη είχαν ελεγχθεί με κυτταρομετρία ροής επόμενης γενιάς για την παρουσία ΕΥΝ σύμφωνα με το πρωτόκολλο του EuroFlow. Επίσης, ελέγχθηκαν πιθανοί συσχετισμοί των υποπληθυσμών με τα διάφορα στάδια της νόσου, το κυτταρογενετικό προφίλ και την ανταπόκριση των ασθενών στην εισαγωγική θεραπεία. Από την αρχική ανάλυση σε δείγματα ΜΟ διαπιστώθηκε ότι η σύσταση του μικροπεριβάλλοντος του ΜΟ δεν εμφανίζει σημαντικές διαφορές στα διάφορα στάδια εξέλιξης του ΠΜ (MGUS, υφέρπον μυέλωμα, ΠΜ, πλασματοκυτταρική λευχαιμία και ΠΜ σε πλήρη ύφεση), ενώ το περιβάλλον του ΜΟ δεν αντικατοπτρίζει το περιβάλλον του ΠΑ σε ζεύγη δειγμάτων ΜΟ-ΠΑ των ίδιων ασθενών. Εξετάζοντας τις προγνωστικές πληροφορίες, βρέθηκε ότι το ανοσολογικό προφίλ διαφέρει στις διάφορες προγνωστικές ομάδες σύμφωνα με το διεθνές σύστημα σταδιοποίησης στο ΠΜ (ISS), αλλά και με το κυτταρογενετικό προφίλ. Στη συνέχεια, διερευνήθηκε η απάντηση στη θεραπευτική αντιμετώπιση και βρέθηκε ότι σχετίζεται με συγκεκριμένη ανοσολογική υπογραφή κατά τη διάγνωση, ενώ αναλύοντας το ανοσολογικό προφίλ του ΜΟ μετά τη θεραπεία, διαπιστώθηκε ότι οι ασθενείς αρνητικοί για την παρουσία ΕΥΝ, έχουν ξεχωριστή ανοσολογική υπογραφή. Τέλος, αναλύοντας το ΠΑ ασθενών κατά την πλήρη ύφεση, βρέθηκε ότι το ποσοστό των παρθένων και των δραστικών/δραστικών-μνήμης CD4+ T λεμφοκυττάρων σχετίζονται με αρνητική ΕΥΝ και επιπλέον, κατασκευάσαμε έναν υπολογιστικό αλγόριθμο, όπου με βάση την έκφραση αυτών των υποπληθυσμών σε ανεξάρτητη ομάδα 20 ασθενών, επιτεύχθηκε η πρόβλεψη της ΕΥΝ με ευαισθησία 86% και ειδικότητα 85%. Συνολικά, στο πλαίσιο αυτής της διατριβής κατασκευάστηκε ex vivo πλατφόρμα εξατομικευμένης εκτίμησης της ανταπόκρισης στη θεραπεία ασθενών με ΠΜ, η οποία δύναται να χρησιμοποιηθεί για περαιτέρω μελέτες και διερευνήθηκαν οι κυτταρικοί υποπληθυσμοί στο περιβάλλον της νόσου. Δείχθηκε ότι το ανοσολογικό μικροπεριβάλλον στο ΠΜ είναι δυναμικό και αποκτά διακριτά ανοσολογικά προφίλ στα διάφορα στάδια της νόσου όπως και στις διάφορες προγνωστικές ομαδοποιήσεις των ασθενών. Επιπλέον, αναδείχθηκε η ύπαρξη ανοσολογικής υπογραφής προγνωστικής αξίας, σχετιζόμενης με τη θεραπευτική ανταπόκριση και την παρουσία ΕΥΝ. Φαίνεται ότι η εξατομικευμένη ανάλυση του ανοσολογικού προφίλ στο ΠΜ μπορεί να συμβάλλει θετικά στη βελτιστοποίηση της θεραπευτικής διαδρομής των ασθενών.