Σύνθεση και μελέτη μοριακών και υπερμοριακών συστημάτων σε διάλυμα

Abstract

The synthesis, characterisation and studies of biologically important properties of novel β- and γ-cyclodextrin (CD) derivatives are described in the present Ph.D. dissertation. The new cyclodextrins are fully modified in their primary side by two kinds of substituents: (a) aliphatic diamines of two, three or six carbon atoms or (b) guanidyloalkylamines of the same chain length. The novel aminoalkylamino- derivatives (11-15) were synthesized, upon reaction of the key intermediates heptakis(6-bromo-6-deoxy)-βCD (6) and oktakis(6-bromo-6-deoxy)-γCD (7) with the appropriate aliphatic diamines, under conditions of high temperature (80°C) and nitrogen pressure (7 Atm). No protection of one of the two amine groups was required, due to the large excess of the diamine used and the absence of a solvent. Transformation of the terminal primary amino groups into guanidino groups afforded the guanidylalkylamino- derivatives (16-20). All new compounds were fully characterised by 1D and 2D NMR spectroscopy, elemental analysis and mass spectrometry. Connectivity of the substituents to the cyclodextrin ring was established by 2D NMR spectroscopy. Additionally, the pKa constants of two representative derivatives (14 and 19) were determined by titration, using 13C NMR spectroscopy. The determined pKa1 and pKa2 values were 6.5, 8.5 for the amine 14 and 7.9, 9.8 for the corresponding guanidine 19. These results revealed that, at physiological (neutral) pH, there is at least one positive charge per substituent group, thus the compounds were isolated as the corresponding HCl salts by standard workup. In the next step, the ability of the new derivatives to interact with DNA was studied by agarose gel electrophoresis using Ultrapure Calf Thymus DNA (~8,6 MDa, >13 kb), atomic force microscopy (AFM) using linear or plasmid DNA and cyclic dichroism (CD) using plasmid DNA. During electrophoresis, DNA alone develops normally, whereas its mobility decreases or is completely inhibited in the presence of any cyclodextrin derivative, depending on the DNA/compound mass/charge ratio used. This phenomenon is attributed to electrostatic interaction between the two components, which cause the partial neutralisation of the DNA negative charges. The electrophoresis experiments showed that the interactions become stronger by increasing the length of the substituent’s aliphatic chain, as well as by changing the functional group from amine to guanidine. This latter observation is in agreement with the pKa values reported above. Use of the unsubstituted cyclodextrins (i.e. α-, β- and γCD), as well as guanidine hydrochloride, at mass/charge ratios equivalent to those used for the new compounds, did not affect the electrophoretic development of DNA. These results indicate that the DNA/compound interaction may involve some specific binding between the components, as opposed to non-specific binding observed with small polyamines. Finally, the CD experiments confirmed the influence of the new compounds in the DNA structure, whereas the AFM experiments on mica substrates showed that DNA is condensed by the cyclodextrin derivatives into disc-like particles of ~100 nm diameter and ~10 nm height. The new compounds (except for 13 and 18) were tagged with a fluorescent dye, in order to image their possible entrance into cells by fluorescence microscopy during cell permeation experiments. Thus, fluorescein-labelled derivatives 22-29 were prepared and their penetration into HeLa cancer cells was examined by fluorescence microscopy. Specifically, incubation of the cells in a medium containing 50-100 μM of the labeled derivatives for 15 minutes to 24 hours showed that all of them are able to penetrate the cell membrane, but the guanidines are more effective than the corresponding amines, since they produced fluorescent images within 15 minutes. In blank experiments, cells were incubated with a βCD/fluorescein mixture, as well as with mono(6-amino-6-deoxy)-βCD tagged with fluorescein (21), under conditions identical to those for the tagged compounds 22-29. The compounds tested did not exhibit any cell membrane penetration properties. These experiments showed that the new CD derivatives are cell penetrating CDs (CPCDs), a property demonstrated for the first time for cyclodextrin derivatives. The amino- functionality of compounds 11-15, being amenable to conjugation to cargo molecules through a suitable spacer, could therefore be used to carry molecules of biological interest inside cells. Finally, the cytotoxicity of every derivative (except for 13 and 18) was determined by MTT assays. Specifically, the IC50 values of compounds 11-12, 14-17 and 19-20 for 24-hour incubation were between 30 and 250 μM, whereas some commercially available, cyclodextrin-based drug carriers have IC50 values in the order of millimolars, but for incubation times of less than 2 hours, indicating satisfactory toxicity profiles of the novel derivatives.

Στην παρούσα διατριβή περιγράφεται η σύνθεση, ο χαρακτηρισμός και μελέτες σημαντικών βιολογικών ιδιοτήτων νέων παραγώγων της β- και γ-κυκλοδεξτρίνης (CDs). Οι ενώσεις που παρασκευάστηκαν είναι πλήρως τροποποιημένες στην πρωτοταγή πλευρά με υποκαταστάτες (α) αλειφατικές διαμίνες δύο, τριών ή έξι ατόμων άνθρακα ή (β) γουανιδινοαλκυλαμίνες αντιστοίχου μήκους αλειφατικής αλυσίδας. Με πρώτη ύλη τα ενδιάμεσα παράγωγα επτακις(6-βρωμο-6-δεοξυ)-βCD (6) και οκτακις(6-βρωμο-6-δεοξυ)-γCD (7) και τις κατάλληλες αλειφατικές διαμίνες και εφαρμόζοντας δραστικές συνθήκες θερμοκρασίας και πίεσης (υπό αδρανή ατμόσφαιρα αζώτου), πραγματοποιήθηκε η σύνθεση νέων αμινοαλκυλαμινικών παραγώγων (ενώσεις 11-15). Η εκλεκτική αντίδραση των διαμινών μόνο από τη μία αμινομάδα επετεύχθη με χρήση μεγάλης περίσσειας των εν λόγω αντιδραστηρίων και απουσία διαλύτη, επομένως δεν απαιτήθηκε προστασία της μίας εκ των δύο αμινομάδων. Κατόπιν, με βιβλιογραφική μέθοδο μετατροπής των τελικών πρωτοταγών αμινομάδων σε ομάδες γουανιδίνης, συνετέθησαν τα αντίστοιχα γουανιδυλοαλκυλαμινικά παράγωγα της β- και γ-κυκλοδεξτρίνης (ενώσεις 16-20). Όλα τα προϊόντα χαρακτηρίστηκαν με φασματοσκοπία NMR μίας και δύο διαστάσεων, στοιχειακή ανάλυση και φασματομετρία μάζας. Η ύπαρξη ομοιοπολικού δεσμού μεταξύ των υποκαταστατών και του κυκλοδεξτρινικού δακτυλίου επιβεβαιώθηκε με πειράματα 2Δ NMR. Επιπλέον, προσδιορίστηκαν οι σταθερές διάστασης pKa για δύο αντιπροσωπευτικά παράγωγα (14 και 19), μέσω τιτλοδότησης παρακολουθούμενης με φασματοσκοπία 13C NMR. Οι προσδιοριζόμενες τιμές pKa1 και pKa2 ήταν 6,5, 8,5 για την αμίνη 14 και 7,9, 9,8 για την αντίστοιχη γουανιδίνη 19. Από τα παραπάνω αποτελέσματα, προέκυψε ότι οι ανωτέρω ενώσεις φέρουν τουλάχιστον ένα θετικό φορτίο ανά υποκαταστάτη σε φυσιολογικό (ουδέτερο) pH, επομένως τα απομονωθέντα προϊόντα βρίσκονται υπό τη μορφή των υδροχλωρικών αλάτων τους. Στη συνέχεια, μελετήθηκε η ικανότητα των νέων παραγώγων να αλληλεπιδρούν με DNA θύμου αδένα μόσχου, διεξάγοντας πειράματα ηλεκτροφόρησης σε πηκτή αγαρόζης, μικροσκοπίας ατομικών δυνάμεων (AFM) και φασματοσκοπίας κυκλικού διχρωισμού (CD). Κατά την ηλεκτροφόρηση, το ελεύθερο DNA αναπτύσσεται κανονικώς μέσα στην πηκτή, ενώ, παρουσία κάποιου παραγώγου, η κινητικότητά του μειώνεται ή αναστέλλεται πλήρως, αναλόγως της χρησιμοποιούμενης αναλογίας μάζα/φορτίο των δύο ενώσεων. Το φαινόμενο αυτό οφείλεται στη μεταξύ τους ηλεκτροστατική αλληλεπίδραση και έχει ως αποτέλεσμα τη μερική εξουδετέρωση των αρνητικών φορτίων του DNA. Από τα αποτελέσματα των πειραμάτων αυτών προέκυψε ότι η ισχύς της αλληλεπίδρασης αυξάνεται αυξανομένου του μεγέθους της αλειφατικής αλυσίδας των υποκαταστατών των παραγώγων, καθώς και κατά τη μετάβαση από τα αμινικά στα γουανιδινικά παράγωγα. Η τελευταία παρατήρηση βρίσκεται σε συμφωνία με τις προαναφερθείσες τιμές pKa. Χρησιμοποίηση των μη υποκατεστημένων κυκλοδεξτρινών α-, β- και γCD, καθώς και της υδροχλωρικής γουανιδίνης, σε αναλογίες μάζα/φορτίο ισοδύναμες με εκείνες που χρησιμοποιήθηκαν για τις νέες ενώσεις, δεν επηρέασε την ηλεκτροφορητική ανάπτυξη του DNA. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ότι η αλληλεπίδραση DNA-χημικής ένωσης πρέπει να περιλαμβάνει εξειδικευμένη πρόσδεση των δύο συστατικών, αντιθέτως με την περίπτωση της μη εκλεκτικής δέσμευσης μικρών πολυαμινών στο DNA. Τέλος, τα πειράματα CD κατέδειξαν την επίδραση των νέων ενώσεων στη δομή του DNA, ενώ από τα πειράματα AFM σε επιφάνεια μίκας προέκυψε ότι η επίδραση αυτή μεταφράζεται σε συμπύκνωση του DNA σε δισκοειδή σωματίδια διαμέτρου ~100 nm και πάχους ~10 nm. Πραγματοποιήθηκε η επισήμανση των νέων παραγώγων (πλην των 13 και 18) με φθορίζουσα χρωστική, με σκοπό τη δυνατότητα παρακολούθησής τους με μικροσκόπιο φθορισμού κατά τη διεξαγωγή πειραμάτων εισαγωγής σε κύτταρα. Κατόπιν, πραγματοποιήθηκε μελέτη της εισαγωγής των επισημασμένων με φλουορεσκεΐνη παραγώγων 22-29 σε καρκινικά κύτταρα HeLa, με μικροσκοπία φθορισμού. Επώαση των κυττάρων σε υγρό καλλιέργειας που περιείχε 50-100 μM από τα νέα παράγωγα, επί 15 λεπτά έως 24 ώρες, έδειξε ότι όλα έχουν την ικανότητα να εισέρχονται στο κυτταρόπλασμα, με τις γουανιδίνες να είναι πιο δραστικές από τις αντίστοιχες αμίνες. Σε πειράματα ελέγχου, επωάστηκαν κύτταρα παρουσία μίγματος βCD/φλουορεσκεΐνης, καθώς και παρουσία μονο(6-αμινο-6-δεοξυ)-βCD επισημασμένης με φλουορεσκεΐνη (21), υπό συνθήκες ίδιες με εκείνες που εφαρμόστηκαν για τις ενώσεις 22-29. Οι ενώσεις ελέγχου δεν παρουσίασαν ικανότητα διείσδυσης σε κύτταρα. Τα παραπάνω αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι τα νέα παράγωγα κυκλοδεξτρινών είναι ενώσεις που διεισδύουν σε κύτταρα (Cell Penetrating CDs, CPCDs), ιδιότητα που παρατηρείται για πρώτη φορά στην οικογένεια των κυκλοδεξτρινών. Έτσι, οι λειτουργικές ομάδες -ΝΗ2 των ενώσεων 11-15, υποβαλλόμενες σε σύζευξη με μόρια βιολογικού ενδιαφέροντος, μέσω κατάλληλης ομάδας «γέφυρας», είναι δυνατό να χρησιμοποιηθούν για τη μεταφορά των μορίων αυτών εντός κυττάρων. Τέλος, προσδιορίστηκε η κυτταροτοξικότητα όλων των νέων ενώσεων (πλην των 13 και 18). Συγκεκριμένα, οι τιμές IC50 των ενώσεων 11-12, 14-17 και 19-20, για επώαση 24 ωρών, κυμαίνονταν μεταξύ 30 και 250 μM, ενώ διάφορα κυκλοδεξτρινικά παράγωγα, που ήδη έχουν βρει εμπορική εφαρμογή ως φορείς φαρμάκων, έχουν τιμές IC50 της τάξης των mΜ, αλλά για χρόνους επώασης 2 ώρες ή λιγότερο. Επομένως, η κυτταροτοξικότητα των νέων παραγώγων κρίνεται ικανοποιητική.