Απομόνωση, κλωνοποίηση, υπερπαραγωγή, βιοχημικός και βιοφυσικός χαρακτηρισμός ενός χιτινολυτικού ενζύμου από το ψυχρόφιλο βακτήριο Moritella marina

Abstract

Chitin, a carbohydrate polymer composed of alternating beta-1,4-linked N-acetylgiucosamine residues, is the second most abundant organic compound in nature. In the aquatic biosphere alone, it is estimated, that more than 10¹¹ tons of chitin are produced annually. Although the deep-sea marine environment is characterized by high hydrostatic pressures and low temperatures, there seems to be a highly active microbial community that is able to decompose chitin. Consequently, the chitinases, produced from the bacteria above, and are responsible for the degradation of the chitin, should have high catalytic activities under these low temperature conditions compared with those of mesophilic and thermophilic species. Psychrophiles are the organisms that live under low temperatures conditions, very often close to 0°C. These organisms live in Antarctica, in the cold oceans, and icebergs, and also on the mountains. They contain many prokaryotic and eukaryotic species, like fungi, seaweed, even archaea. In the context of her PhD thesis, executed at the Laboratory of Biochemistry, Department of Biology, University of Athens, Eleni Stefanidi undertook the isolation of a new chitinase gene, overproduction, biochemical and biophysical study of the recombinant enzyme from the psychrophilic and marine bacterium Moritella marina. Till today, it is the fifth psychrophilic chitinase that has been isolated and one of the four that has been studied inclusively. At the initial stage of the experimental part, a series of factors affecting the growth rate of the culture and the induction of the chitinolytic activity of this psychrophilic bacterium, such as the type of chitin used and the conditions of the bacterial culture, were elucidated. M. marina was cultivated at 15°C in two major types of complex medium: the minimal, inducing medium, containing chitin, as the sole carbon, nitrogen, and energy source, and the rich, non-inducing medium, where chitin was replaced by a variety of nutrient, non-chitinous substrates. The above investigation was performed in order to study the growth rate, as well as, the rate of increase of the chitinolytic activity, during incubation for 48 h. These experiments demonstrated that M. marina produces various chitinolytic enzymes, following induction with various types of chitin. Colloidal chitin exerted the strongest effect, whereas the highest levels of growth rate were obtained in the presence of the medium Marine Broth, which is consisting of yeast extract, peptone and marine salts. M. marina produces several chitinases, which are detected in the soluble cell extract and the supernatant of the inducing culture, as it has been demonstrated with analysis of various samples on a chitinase zymogram and 2-D electrophoresis. At the following stage of the experimental part, a gene for a chitinase was isolated from the psychrophilic bacterium M. marina. The enzyme, MmChi60, was overproduced in E. coli cells and purified. A biochemical and thermodynamic analysis of this psychrophilic protein was performed. The isolation of the chitinase gene from M. marina was carried out following the next procedure. Since we had detected chitinolytic activity of M. marina, we decided to design degenerate primers based on primary structure alignments of bacterial chitinases available in the databases. Those primers were used in polymerase chain reactions. Briefly, three fragments of chitinase gene were amplified. The 1500 bp fragment was amplified from the chromosomal DNA, and the 170 bp and 340 bp fragments were amplified from a chromosomal DNA library of M. marina. All three fragments composed the open reading frame of a chitinase gene from M. marina and parts beyond its 3' and 5' end. The entire chitinase gene, named Mmchi60, 1653 bp size, was isolated as a single product performing a polymerase chain reaction using the bacterial chromosomal DNA. Mmchi60 gene was cloned into the vector pCR 2.1-TOPO for sequencing and the pET-11a vector for overproduction under the T7 promoter. The protein MmChi60 consists of 550 amino acids and contains three function regions, according primary structure analysis. An N-terminal signal peptide of 22 amino acid residues long, an N-terminal catalytic region of the family 18 of glycosylhydrolases (110-154 amino acid residues), and a C-terminal chitin binding domain (ChBD) (507-550 amino acid residues) were identified. The chitinase MmChi60 was overproduced in E. coli BLR(DE3). The protein was soluble and produced at high levels. The purification of MmChi60 was completed successfully after three steps: Ammonium sulfate fractionation, hydrophobic chromatography using the column Phenyl Sepharose CL-6B and anion exchange chromatography using the column Q-Sepharose Fast Flow. The biochemical analysis of MmChi60 has shown that the enzyme presented pH and temperature optima at 5.0 and 28°C, respectively. The MmChi60 is a monomeric protein, with an apparent molecular weight of 60.7 kDa and theoretical isoelectric point of 4.32. The enzyme was characterized by reduced stability at high temperatures and high activity at low temperatures such as 0, 10, and 20°C. Also the protein remained stable and active in the presence of various denaturing agents was unaffected of the presence of metal ions and its activity was abolished by the addition of allosamidin, which is the natural competitive inhibitor of chitinolytic activity. The ability of MmChi60 to hydrolyze various carbohydrates was examined. Concerning the natural substrates, MmChi60 was found to hydrolyze only the substrates derived from chitin such as colloidal chitin and powdered chitosan. Concerning the synthetic substrates, MmChi60 was found to be active only on chitin substrates, like p-nitrophenyl-β-1,4-N,N'-diacetyl-chitobiose, which was used to calculate the values of Vmax, Km, kcat, Εα, ΔG, ΔH and TΔS. The mode of action of MmChi60 on N-acetylchitooligomers and colloidal chitin was examinated using HPLC. MmChi60 resulted to be an endochitinase cleaving chitin substrates randomly. Thermothydamic analysis of MmChi60, using the methods of circular dichroism and differential scanning microcalorimetry, clearly showed that the melting temperature of the protein is 56.5°C. A quite valuable result is that the protein unfolded reversibly even after heating at 65°C, which has been described for the first time for the cold-adapted enzymes of glycosyl-hydrolase family 18 and provides many possibilities for proteomic engineering. The C-terminal chitin binding domain of MmChi60 showed a 36% identity with the ChBD of Streptomyces griseus chitinase C. Therefore its 3-D model was possible to be constructed by homology modeling using the structural data available for the ChiC of S. griseus (PDB 1wvu). The model of the chitin binding domain of MmChi60 exhibited a beta protein with two tryptophan residues i.g. Trp-533 and Trp-534 exposed to the solvent. We suggest that Trp-533 and Trp-534 of MmChi60 may be involved in the interaction with the chitin substrate. Finally, we compared the values of the optimal temperature of enzymatic activity and the melting temperature of MmChi60 with those reported for cold-adapted chitinases, as well as the arginine, proline, and glycine contents of MmChi60 with those of the mesophilic chitinase C of Pseudomonas aeruginosa. The results clearly showed that MmChi60 has properties in common with other cold-adapted enzymes.

Η χιτίνη είναι ένα βιοπολυμερές που αποτελείται από γραμμικά επαναλαμβανόμενες μονάδες Ν-ακετυλογλυκοζαμίνης συνδεδεμένες με β-1.4 γλυκοσιδικό δεσμό και αποτελεί το δεύτερο μετά την κυτταρίνη φυσικό βιοπολυμερές. Στο υδάτινο περιβάλλον υπολογίζεται ότι ανακυκλώνονται ετησίως περισσότεροι από 10¹¹ τόνοι χιτίνης. Στις συνθήκες του βυθού των υδάτινων οικοσυστημάτων, που χαρακτηρίζονται από υψηλές πιέσεις και χαμηλές θερμοκρασίες, ανιχνεύονται ελάχιστες μόνο ποσότητες χιτίνης. Επιπλέον, είναι γνωστό ότι η μικροβιακή κοινότητα που αναπτύσσεται σε αυτές τις συνθήκες ευθύνεται σε σημαντικό βαθμό για την ανακύκλωση της χιτίνης. Σύμφωνα λοιπόν με τα παραπάνω, αναμένεται ότι τα ένζυμα που αποικοδομούν τη χιτίνη και παράγονται από τα βακτήρια αυτού του οικοσυστήματος έχουν υψηλή καταλυτική ενεργότητα σε χαμηλές θερμοκρασίες. Ως ψυχρόφιλους χαρακτηρίζουμε τους οργανισμούς εκείνους που επιβιώνουν σε περιβάλλοντα με χαμηλές θερμοκρασίες και αρκετά συχνά σε θερμοκρασία κοντά στους 0°C. Τέτοιους οργανισμούς συναντάμε στην Ανταρκτική, στους παγωμένους ωκεανούς και τα παγόβουνα, αλλά και σε ορεινές περιοχές. Αντιπρόσωποί τους βρίσκονται σε προκαρυωτικούς και ευκαρυωτικούς οργανισμούς, όπως μύκητες και φύκη, αλλά και στα αρχαιοβακτήρια. Ο στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής, που πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Βιοχημείας του Τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Αθηνών, ήταν η απομόνωση ενός γονιδίου που κωδικοποιεί χιτινολυτικό ένζυμο, η υπερπαραγωγή της αντίστοιχης ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης και η ενζυμική, δομική και θερμοδυναμική μελέτη της τελευταίας από το ψυχρόφιλο και θαλάσσιο βακτήριο Moritella marina. Η χιτινάση αυτή αποτελεί, μέχρι σήμερα, το πέμπτο ψυχρόφιλο χιτινολυτικό ένζυμο που έχει απομονωθεί και ένα από τα τέσσερα που έχουν μελετηθεί τόσο διεξοδικά. Στο αρχικό στάδιο της μελέτης αυτής διερευνήθηκαν αρκετοί παράγοντες που επηρέασαν την ανάπτυξη της καλλιέργειας και την επαγωγή της χιτινολυτικής ενεργότητας του ψυχρόφιλου αυτού βακτηρίου, όπως το είδος της χιτίνης και οι συνθήκες της βακτηριακής καλλιέργειας. Το βακτήριο Μ. marina αναπτύχθηκε στο εργαστήριό μας στους 15°C, με τη χρήση δύο τύπων θρεπτικού υλικού, το επαγωγικό, που περιέχει χιτίνη, ως αποκλειστική πηγή άνθρακα, αζώτου και ενέργειας, και το μη επαγωγικό, στο οποίο η χιτίνη έχει αντικατασταθεί από πλήρες θρεπτικό υλικό. Μελετήθηκαν ο ρυθμός κυτταρικής αύξησης, καθώς και ο ρυθμός αύξησης της χιτινολυτικής ενεργότητας σε συνολικό χρονικό διάστημα επώασης 48 h. Διαπιστώθηκε ότι το ψυχρόφιλο βακτήριο Μ. marina παράγει μια σειρά από χιτινολυτικά ένζυμα, μετά από επαγωγή με διάφορες μορφές χιτίνης. Η εντονότερη επαγωγή εκδηλώθηκε παρουσία κολλοειδούς χιτίνης (ημι-διαλυτή μορφή χιτίνης), ενώ τα υψηλότερα επίπεδα κυτταρικής αύξησης παρατηρήθηκαν παρουσία του πλήρους θρεπτικού μέσου Marine Broth, το οποίο αποτελείται από εκχύλισμα ζύμης, πεπτόνη και διάφορα άλατα που ανιχνεύονται στο θαλασσινό νερό. Όπως αποδείχθηκε με τη χρήση ενζυμογράμματος χιτινάσης και ηλεκτροφόρησης δύο διαστάσεων, το βακτήριο Μ. marina παράγει περισσότερες από μια χιτινάσες, οι οποίες εντοπίζονται τόσο ενδοκυτταρικά όσο και εξωκυτταρικά. Στα επόμενα στάδια του πειραματικού μέρους της διατριβής, απομονώθηκε ένα γονίδιο χιτινάσης από το ψυχρόφιλο βακτήριο Μ. marina. Το αντίστοιχο ένζυμο υπερπαράχθηκε σε κύτταρα E. coli, καθορίσθηκε και μελετήθηκε βιοχημικά και βιοφυσικά. Πρόκειται για μια νέα χιτινάση, την MmChi60. Η απομόνωση του γονιδίου χιτινάσης από το βακτήριο Μ. marina, ακολούθησε την παρακάτω διαδικασία. Εφόσον είχε ήδη ανιχνευθεί χιτινολυτική ενεργότητα από το βακτήριο αυτό, σχεδιάστηκαν συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια βάσει ομόλογων περιοχών που αναδείχθηκαν από τη στοίχιση προκαρυωτικών χιτινασών που καταγράφονται στις διεθνείς βάσεις δεδομένων. Τα παραπάνω ολιγονουκλεοτίδια χρησιμοποιήθηκαν ως εκκινητές σε αλυσιδωτές αντιδράσεις της πολυμεράσης. Συνολικά απομονώθηκαν τρία τμήματα DNA. Το τμήμα μήκους 1500 bp απομονώθηκε από το χρωμοσωμικό DNA, ενώ τα τμήματα μήκους 170 bp and 340 bp απομονώθηκαν από μια χρωμοσωμική βιβλιοθήκη του Μ. marina. Τα παραπάνω τμήματα συνθέτουν το ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης ενός γονιδίου χιτινάσης του Μ. marina και τμήματα που εκτείνονται πέρα των 3' και 5' άκρων του γονιδίου αυτού. Το γονίδιο χιτινάσης Mmchi60, μήκους 1653 bp, απομονώθηκε ως προϊόν από αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης με τη χρήση χρωμοσωμικού DNA του βακτηρίου Μ. marina. Το γονίδιο Mmchi60 κλωνοποιήθηκε στον πλασμιδιακό υποδοχέα pCR 2.1-TOPO, με σκοπό την αλληλούχιση και στον πλασμιδιακό υποδοχέα pET-11a, με σκοπό την υπερπαραγωγή της αντίστοιχης πρωτεΐνης υπό τον έλεγχο του Τ7 υποκινητή. Η πρωτεΐνη MmChi60 αποτελείται από 550 αμινοξέα και περιέχει τρεις δομικές περιοχές, σύμφωνα με ανάλυση της πρωτοταγούς δομής της: το αμινοτελικό “πεπτίδιο οδηγό” (1-22 αμινοξικά κατάλοιπα), την αμινοτελική καταλυτική περιοχή που χαρακτηρίζει τις γλυκοσύλ-υδρολάσες της οικογένειας 18 (110-154 αμινοξικά κατάλοιπα) και τη καρβοξυτελική δομική περιοχή πρόσδεσης στη χιτίνη (507-550 αμινοξικά κατάλοιπα). Η υπερπαραγωγή της χιτινάσης MmChi60 πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα E. coli BLR(DE3) και σε υψηλά επίπεδα. Η πρωτεΐνη εντοπίστηκε στο ενδοκυτταρικό και ευδιάλυτο κλάσμα. Ο καθαρισμός της MmChi60 ολοκληρώθηκε επιτυχώς σε τρία βήματα: κλασμάτωση των ευδιάλυτων πρωτεϊνών του κυτταρικού εκχυλίσματος με θεϊικό αμμώνιο, χρωματογραφία υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων σε στήλη Phenyl Sepharose CL-6B και ανιοανταλλακτική χρωματογραφία σε στήλη Q-Sepharose Fast Flow. Ακολούθησε πλήρης βιοχημικός χαρακτηρισμός χρησιμοποιώντας καθαρά κλάσματα της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης. Προσδιορίστηκε, έτσι, το βέλτιστο pH στο 5.0 και η βέλτιστη θερμοκρασία ενζυμικής αντίδρασης στους 28°C, με τη χρήση του συνθετικού υποστρώματος της παρα-νιτροφαινυλ-β-1,4-Ν,Ν'-δυακετυλ-χιτοβιόζης. Η MmChi60 είναι μια μονομερής πρωτεΐνη με μοριακό βάρος 60.7 kDa και θεωρητικό ισοηλεκτρικό σημείο 4.32. Η χιτινάση MmChi60 παρουσίασε σημαντική θερμοευαισθησία, αλλά και υψηλή ενεργότητα σε χαμηλές θερμοκρασίες, όπως 0, 10 και 20°C. Επίσης αξιοσημείωτη ήταν η χημική σταθερότητά της έναντι μιας σειράς αλκυλιωτικών, αναγωγικών και αποδιατακτικών παραγόντων, η μη εξάρτησή της από μέταλλα και η καταστολή της ενεργότητας της από το φυσικό συναγωνιστικό αναστολέα της χιτινολυτικής ενεργότητας, την αλλοζαμιδίνη. Η ενεργότητα της MmChi60 μελετήθηκε παρουσία φυσικών και συνθετικών υποστρωμάτων που προέρχονται από τη χιτίνη και από άλλους πολυσακχαρίτες. Η MmChi60 ήταν ενεργή έναντι μόνο των φυσικών υποστρωμάτων χιτίνης, όπως η κολλοειδής χιτίνη και χιτοζάνη, καθώς και των συνθετικών υποστρωμάτων χιτίνης, όπως η παρα-νιτροφαινυλ-β-1,4-Ν,Ν'-δυακετυλ-χιτοβιόζη, για την οποία προσδιορίστηκαν οι κινητικές παράμετροι Vmax, Km, kcat, Εα, ΔG, ΔΗ και TΔS. Τα προϊόντα ενζυμικής δράσης της MmChi60 σε υποστρώματα Ν-ακετυλ-χιτοολιγομερή και κολλοειδούς χιτίνης αναλύθηκαν με τη χρήση HPLC. Η MmChi60 αποδείχθηκε ότι είναι μια ενδοχιτινάση, που υδρολύει υποστρώματα χιτίνης σε τυχαίες θέσεις. Η θερμοδυναμική ανάλυση της MmChi60, με τη χρήση των μεθόδων κυκλικού διχρωισμού και μικροθερμιδομετρίας διαφορικής σάρωσης, έδειξε ότι η θερμοκρασία τήξης της πρωτεΐνης είναι 56.5°C. Επίσης ιδιαίτερα σημαντικό αποτέλεσμα είναι ότι η πρωτεΐνη αποδιατάχθηκε αντιστρεπτά ακόμα και μετά από επώαση στους 65°C, γεγονός που περιγράφεται για πρώτη φορά σε ψυχρόφιλα ένζυμα των γλυκοσύλυδρολασών της οικογένειας 18 και παρέχει σημαντικές δυνατότητες για τη χρήση της ψυχρόφιλης αυτής πρωτεΐνης στην πρωτεϊνική μηχανική. Η δομική περιοχή πρόσδεσης στη χιτίνη της MmChi60 παρουσίασε ομοιότητα σε ποσοστό 36% με την αντίστοιχη περιοχή της χιτινάσης C από το βακτήριο Streptomyces griseus. Η ένδειξη αυτή μας επέτρεψε την κατασκευή του δομικού προτύπου της περιοχής πρόσδεσης στη χιτίνη της MmChi60 βάσει ομολογίας με τη δομή της χιτινάσης C του S. griseus (PDB 1wvu). Το πρότυπο αυτό ανέδειξε μια δομή με β-πτυχωτά φύλλα, με δύο τρυπτοφάνες, Trp-533 και Trp-534, να εκτείνονται προς το διάλυμα, οι οποίες προτείνονται ότι πιθανόν να σχετίζονται με την αλληλεπίδραση του ενζύμου με το υπόστρωμα της χιτίνης. Τέλος, πραγματοποιήθηκε σύγκριση των τιμών της βέλτιστης θερμοκρασίας δράσης και θερμοκρασίας τήξης της MmChi60 και ψυχρόφιλων χιτινασών, καθώς και της περιεκτικότητας σε αργινίνες, προλίνες και γλυκίνες της MmChi60 και της μεσόφιλης χιτινάσης C του βακτηρίου Pseudomonas aeruginosa. Τα αποτελέσματα έδειξαν ξεκάθαρα ότι η MmChi60 παρουσιάζει χαρακτηριστικά ψυχρόφιλου ενζύμου.