Μελέτη της δομής και αλληλεπίδρασης συμπλόκων ενώσεων του αντικαρκινικού φαρμάκου μπλεομυκίνη στο DNA με φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού και προσομοιώσεις μοριακής δυναμικής

Abstract

The solution structure of three complexes of the anticancer drug bleomycin (BLM) has been carried out using high-field NMR methods in combination with molecular dynamics simulations. The stability of Ga(III)-BLM has allowed us to assign all the exchangeable amine and amide protons for the first time, which in turn was proven to be a valuable piece of information for its solution structure [1]. NMR data were used as constraints in conjunction with simulated annealing molecular dynamics calculations. The NMR structure revealed that Ga(III)-BLM shares a similar structure with Co(III)-BLM complexes. By virtue of the fact that Ga(III) adducts are used as a probe for the biologically relevant Fe(III) compounds, their binding mode with BLM is proposed to be similar. Additionally, its interaction with the self-complementary oligonucleotide d(CCAGGCCTGG)2 was investigated by means of NMR. Our data, in comparison with those obtained for Co(III)-BLM, indicate that the drug binds strongly via intercalation of the bithiazole moiety between the central d(-CC-) step and that the pyrimidine ring of BLM might be involved in the formation of a base-triple-like interaction with the adjacent (G·C) base pair. This was the basis for the sequence specificity of DNA cleavage mediated by BLM at d(G-C) and d(C-T) sequences. Employing the same methods, we have also determined the solution structure of In(III)-BLM, which is successfully applied as radioactive imaging agent [2]. Studies were performed at acidic solutions as well, with the aim to investigate whether structural changes could occur upon preparation of the kit for clinical use. The results indicate that In(III)-BLM has a similar structure with that of Ga(III)-BLM, which is not dependent on the acidity. Finally, the interaction of Pd(II) ions with BLM was studied in solutions with high ionic strength [3]. In this way, it was found that one major species is present, which was characterized using NMR and molecular modeling. Experimental data indicate that BLM binds to Pd(II) via the four common nitrogen donor atoms. The NMR structure exhibits that the drug is folded around the coordination sphere, a fact that was attributed to intramolecular hydrogen bonding interactions, either directly or mediated by solvent molecules and chlorine anions. The kinetically more inert Pt(II) ions result in the formation of several species when interacting with BLM, but on the other hand, their similarity with Pd(II) supports the suggestion that both metals form the same adducts with BLM. The force field AMBER(96) has been used throughout the molecular dynamics calculations, which was carefully parameterized in order to accurately represent the above compounds. All atom-centered point charges were derived from the electrostatic potential of BLM molecular fragments, which was calculated using the ab initio program GAMESS

Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκε η δομή τριών συμπλόκων του αντικαρκινικού φαρμάκου μπλεομυκίνη (BLM) σε υδατικά διαλύματα, χρησιμοποιώντας τεχνικές NMR υψηλού πεδίου σε συνδυασμό με θεωρητικούς υπολογισμούς μοριακής δυναμικής. Η σταθερότητα του συμπλόκου Ga(III)-BLM μας προσέφερε τη δυνατότητα να αποδώσουμε για πρώτη φορά τις αμινικές και αμιδικές ομάδες του υποκαταστάτη, γεγονός που αποδείχτηκε ιδιαίτερα σημαντικό ως προς τη δομή του συμπλόκου σε διάλυμα [1]. Τα αποτελέσματα των μοριακών προσομοιώσεων με τα πειραματικά δεδομένα ως περιορισμούς καταλήγουν σε μία δομή με γεωμετρία που έχει προταθεί για τα σύμπλοκα του Co(III)-BLM. Δεδομένης της ομοιότητας του Ga(III) με το βιολογικού ενδιαφέροντος Fe(III), προτείνεται ότι η δομή των δύο συμπλόκων τους με τη BLM θα πρέπει να είναι όμοια. Μελετήθηκε επιπλέον η αλληλεπίδραση του Ga(III)-BLM με το δεκανουκλεοτίδιο d(CCAGGCCTGG)2 βάση των δεδομένων NMR. Σε σύγκριση με την αντίστοιχη μελέτη των συμπλόκων του Co(III)-BLM, βρέθηκε ότι συνδέονται ισχυρά μέσω εισαγωγής των διθειαζολικών δακτυλίων ανάμεσα στις κεντρικές βάσεις d(-CC-), καθώς ο πυριμιδινικός δακτύλιος του φαρμάκου συμμετέχει σε μια αλληλεπίδραση «τριπλής βάσης» με το γειτονικό ζεύγος (G·C). Το γεγονός αυτό είναι η βασική αρχή της εκλεκτικότητας που επιδεικνύει η ενεργοποιημένη BLM για οξειδωτική κοπή σε αλληλουχίες d(GC) και d(GT). Με τις ίδιες μεθόδους, μελετήθηκε για πρώτη φορά επίσης η δομή του ραδιογνωστικού παράγοντα In(III)-BLM που εφαρμόζεται με επιτυχία κλινικά [2]. Η μελέτη έγινε επιπλέον σε όξινα υδατικά διαλύματα, με σκοπό να διερευνηθούν τυχόν δομικές μεταβολές που επέρχονται κατά την παρασκευή του σκευάσματος που χρησιμοποιείται. Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η δομή του In(III)-BLM είναι παρόμοια με αυτή του Ga(III)-BLM, ανεξαρτήτως της οξύτητας του διαλύματος. Τέλος, μελετήθηκε η αλληλεπίδραση των ιόντων Pd(II) με τη BLM σε διαλύματα υψηλής ιοντικής ισχύος [3]. Με αυτό τον τρόπο έγινε δυνατή η παρασκευή ενός κύριου προϊόντος που χαρακτηρίστηκε με τεχνικές NMR και μοριακές προσομοιώσεις. Τα πειραματικά δεδομένα υποδεικνύουν ότι η BLM συνδέεται στο Pd(II) μέσω των τεσσάρων ατόμων αζώτου που είναι και οι συνήθης υποκαταστάτες. Στη δομή NMR που υπολογίστηκε, το φάρμακο παρουσιάζεται να είναι αναδιπλωμένο γύρω από τη σφαίρα σύνταξης, γεγονός που αποδόθηκε σε ενδομοριακούς δεσμούς υδρογόνου, είτε μεταξύ των πολικών ομάδων του υποκαταστάτη απ’ ευθείας, είτε μέσω αλληλεπίδρασης με μόρια του διαλύτη και ανιόντα χλωρίου. Με τα κινητικώς αδρανέστερα ιόντα Pt(II) δεν έγινε εφικτή η προετοιμασία ενός κύριου είδους, αλλά βάση της ομοιότητας που έχουν με το Pd(II) προτείνεται ότι η δομή του συμπλόκου με τη BLM θα είναι παρόμοια. Για τους υπολογισμούς μοριακής δυναμικής χρησιμοποιήθηκε το πεδίο AMBER(96), στο οποίο έγινε κατάλληλη παραμετροποίηση ώστε να προσομοιωθούν τα σύμπλοκα με μεγάλη ακρίβεια. Τα ατομικά φορτία των συμπλόκων εξήχθησαν από το ηλεκτροστατικό δυναμικό μοριακών τμημάτων, τα οποία υπολογίστηκαν σε επίπεδο κβαντικής μηχανικής με το πρόγραμμα GAMESS