Ανάπτυξη μεθόδου ταυτόχρονου ανοσοχημικού προσδιορισμού καρδιακών δεικτών με τη χρήση τριχοειδούς οπτικού ανοσοαισθητήρα

Abstract

In the context of this dissertation, a capillary optical immunosensor for the simultaneous determination of cardiac markers in the same sample was developed. This immunosensor was employed for the simultaneous detection of creatine kinase isoenzyme MB (CK-MB) and the subunit I of cardiac troponin complex (cTnI) in human serum samples. These molecules present highly cardiospecificity and are widely used in the clinical practice for the detection of acute coronary syndromes. The immunosensor was based on glass capillaries serving as optical waveguides, solid supports for the immobilization of bio-recognition molecules and immunoreaction tubes. The expected increase of the immunoreaction rate due to the high surface to volume ratio, and the low consumption of reagents were the reasons why the cylindrical geometry was selected for the fabrication of the immunosensor. A method for grafting of an ultra-thin Poly-(dimethylsiloxane) (PDMS) film on the internal surface of capillaries using an emulsion of the polymer was developed as the first step for the immobilization of biomolecules. This method is simple, faster than other literature methods, low cost, suitable for mass production, does not require the use organic solvents and can be applied in non-cylindrical surfaces. The PDMS-grafted capillaries combined the perfect optical properties of the glass with the high protein binding capacity of the polymer. In addition, they provided a more homogeneous immobilization of biomolecules as compared to glass capillaries chemically modified with 3-aminopropyl(triethoxysilane) (APTES), one of the most widely used glass modification agents. The simultaneous determination of CK-MB and cTnI was based on the creation of two distinct bioreactive bands on the internal surface of the PDMS-grafted capillaries. The creation of bands was accomplished by dispensing a suitable solution volume of the specific antibody raised against each cardiac marker at pre-defined parts of the capillary. This method was fast and easy to use compared to photolithographic and photochemical techniques, described in the literature for patterning of glass and plastic capillaries. The immunoassay of each cardiac marker was initially developed in microtitration wells so as to obtain a standard method for comparison of the analytical characteristics and the reliability of the developed dual-analyte immunosensor regarding the measurement of serum samples. The standard solutions were prepared in human serum using CK-MB and cardiac troponin complex (cTnICT). Cardiac troponin complex was employed since cTnI is mainly bound with subunit C and/or T when released to the blood circulation after myocardial infarction. For the determination of CK-MB, the capture monoclonal antibody employed, was raised against CK-MB, whereas the detection monoclonal antibody was raised against CK-BB, since this combination provided increased selectivity. For the determination of cTnI, the capture monoclonal antibody raised against cTnI was combined with two detection antibodies. The first one recognized a different epitope on cTnI molecule than the capture antibody, whereas, the second recognized an epitope on the cTnC molecule. The combination of the three antibodies permitted the detection of all forms of the analyte in blood at much lower concentrations compared to the rest of the antibody combinations examined. The enzyme horseradish peroxidase and R-phycoerythrin were tested as potential labels for the assays performed both in microtitration wells and in capillaries. In microtitration wells, the enzyme label was paired with a common chromogenic substrate, whereas in capillary immunosensor a signal amplification system based on a tyramide derivative conjugated with Alexa Fluor 488 (TSA-AF488) was adopted as substrate. Both methods were compared in terms of their analytical characteristics, employing the same label (R-phycoerythrine). The detection limits achieved using the multi-analyte capillary fluoroimmunosensor were significantly lower than those obtained from the respective fluoroimmunoassays performed in microtitration wells. Moreover, a reduction of 92% in the total analysis time was achieved with the proposed immunosensor compared with the respective assays conducted in microtitration wells. However, the combination of the enzyme label and the TSA-AF488 substrate permitted the detection of very low concentrations of cTnI and CK-MB in considerably shorter time and consequently was adopted in the protocol for the final validation of the immunosensor. .........................................

Στη παρούσα διατριβή αναπτύχθηκε τριχοειδής οπτικός ανοσοαισθητήρας για τον ταυτόχρονο προσδιορισμό καρδιακών δεικτών στο ίδιο δείγμα. Ο ανοσοαισθητήρας χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση τoυ ισοενζύμου ΜΒ της κινάσης της κρεατίνης (CK-MB) και της υπομονάδας Ι του συμπλόκου της καρδιακής τροπονίνης (cTnI) ταυτοχρόνως σε δείγματα ανθρώπινου ορού αίματος. Τα μόρια αυτά εμφανίζουν υψηλή καρδιοειδικότητα και χρησιμοποιούνται ευρέως στα πλαίσια της εργαστηριακής ανάλυσης για την αντιμετώπιση των οξέων στεφανιαίων συνδρόμων. Ο ανοσοαισθητήρας βασίστηκε σε τριχοειδή που χρησίμευσαν ως οπτικοί κυματοδηγοί, στερεοί φορείς ακινητοποίησης βιομορίων αναγνώρισης και φιαλίδια ανοσοαντίδρασης. Οι λόγοι που οδήγησαν στην επιλογή της τριχοειδούς γεωμετρίας ήταν η αναμενόμενη αύξηση της ταχύτητας των ανοσοαντιδράσεων εξαιτίας του αυξημένου λόγου ενεργής επιφάνειας προς όγκο δείγματος και η μειωμένη κατανάλωση αντιδραστηρίων. Για την ακινητοποίηση των βιομορίων, αναπτύχθηκε μέθοδος επίστρωσης υπερλεπτών υμενίων πολυδιμεθυλο(σιλοξανίου) (PDMS) στην εσωτερική επιφάνεια των υάλινων τριχοειδών χρησιμοποιώντας γαλάκτωμα πολυμερούς. Η μέθοδος αυτή είναι απλή, ταχύτερη από άλλες μεθόδους της βιβλιογραφίας, κατάλληλη για μαζική παραγωγή, δεν χρησιμοποιεί οργανικούς διαλύτες, εμφανίζει μικρό κόστος και δύναται να εφαρμοστεί σε μη κυλινδρικές επιφάνειες. Τα επιστρωμένα με PDMS τριχοειδή συνδύασαν τις πολύ καλές οπτικές ιδιότητες της ύαλου με την υψηλή ικανότητα προσρόφησης πρωτεϊνών που παρέχουν τα πολυμερή. Επιπλέον παρείχαν υψηλότερη ομοιογένεια ακινητοποιημένων βιομορίων σε σύγκριση με υάλινα τριχοειδή χημικώς τροποποιημένα με 3-αμινοπροπυλο(τριεθοξυσιλάνιο) (APTES), ένα από τα συνηθέστερα αντιδραστήρια τροποποίησης υάλινων επιφανειών. Ο ταυτόχρονος προσδιορισμός των cTnI και CK-MB επιτεύχθηκε με την κατασκευή δύο βιοδραστικών ζωνών στο εσωτερικό του επιστρωμένου με PDMS υάλινου τριχοειδούς. Η κατασκευή των ζωνών πραγματοποιήθηκε με εναπόθεση κατάλληλου όγκου διαλύματος από το προς ακινητοποίηση ειδικό αντίσωμα κάθε καρδιακού δείκτη σε προκαθορισμένες θέσεις του τριχοειδούς, καθώς η μεθοδολογία αυτή ήταν ταχύτερη και απλούστερη σε σύγκριση με φωτολιθογραφικές και φωτοχημικές τεχνικές σχηματοποίησης που έχουν περιγραφεί στη βιβλιογραφία. Ο ανοσοπροσδιορισμός κάθε καρδιακού δείκτη αναπτύχθηκε αρχικά σε φρεάτια μικροτιτλοδότησης, με σκοπό να αποτελέσει μέθοδο σύγκρισης των αναλυτικών χαρακτηριστικών και της ακρίβειας των μετρήσεων σε δείγματα ορού αίματος του τριχοειδή ανοσοαισθητήρα. Για τη παρασκευή των προτύπων διαλυμάτων των προσδιορισμών σε ανθρώπινο ορό αίματος χρησιμοποιήθηκαν CK-MB και το τριπλό σύμπλοκο της καρδιακής τροπονίνης (cTnICT). Η χρήση του συμπλόκου της τροπονίνης βασίστηκε στο γεγονός ότι η cTnI ελευθερώνεται στην κυκλοφορία του αίματος έπειτα από έμφραγμα του μυοκαρδίου συνδεδεμένη κυρίως με την υπομονάδα C ή και την Τ και ελάχιστα ως ελεύθερη. Για τον προσδιορισμό της CK-MB χρησιμοποιήθηκε ως αντίσωμα ακινητοποίησης μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι της CK-MB και ως αντίσωμα ανίχνευσης μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι της CK-B καθώς ο συνδυασμός αυτός εξασφάλιζε την ειδικότητα της μεθόδου. Για τον προσδιορισμό της cTnI χρησιμοποιήθηκε μονοκλωνικό αντίσωμα ακινητοποίησης έναντι της cΤnΙ σε συνδυασμό με δύο μονοκλωνικά αντισώματα ανίχνευσης. Το ένα εκ των οποίων συνδεόταν στην cTnI σε διαφορετικό επίτοπο του αναλύτη από ό,τι το αντίσωμα ακινητοποίησης ενώ το δεύτερο συνδεόταν με την cTnC. Ο συνδυασμός των τριών αντισωμάτων παρείχε δυνατότητα ανίχνευσης όλων των τύπων του αναλύτη στο αίμα και πολύ μικρότερων συγκεντρώσεων cTnI σε σχέση με άλλους συνδυασμούς αντισωμάτων που εξετάστηκαν. Τόσο στα φρεάτια μικροτιλοδότησης όσο και στα τριχοειδή εξετάστηκαν δύο ιχνηθέτες, το ένζυμο υπεροξειδάση της ραπανίδος και η R-φυκοερυθρίνη. Ο ενζυμικός ιχνηθέτης στα μικροφρεάτια συνδυάστηκε με χρωμογόνο υπόστρωμα ενώ στον τριχοειδή ανοσοαισθητήρα με παράγωγο τυραμιδίου συζευγμένο με τη φθορίζουσα Alexa fluor 488 (TSA-AF488) ως σύστημα ενίσχυσης του οπτικού σήματος. ............................................