Συσχέτιση του φαινομένου της ρετρομετάθεσης με την επαγόμενη γενωμική αστάθεια

Abstract

The regulation of retrotransposition is not known. Several studies had reported that different families of retrotransposons, including VL30s, were transcriptionally active and mobilized in cancer cells characterised by genome instability. Aim of the present study was the correlation between the phenomena of VL30 retrotransposition and induced genomic instability. To this end, we constructed: a recombinant VL30 retrotransposon tagged with an EGFP gene based retrotransposition cassette and a NIH3T3 cell-retrotransposition assay, harbouring the recombinant VL30, used for detection and measurement of retrotransposition events. Initially, transfection of the recombinant VL30 element produced retrotransposition events in two established SV40-transformed mouse NIH3T3 cell lines, SVTT1 and Ca, but not in normal NIH3T3 cells. Then we investigated the effect of SV40 large T antigen on induction of retrotransposition using the cell-retrotransposition assay. Ectopic expression of either a wild-type or mutant LE1135T large T antigen gene, not expressing small t protein, induced retrotransposition events at high frequencies. In addition, measuring retrotransposition frequencies over a period of nine days following infection of assay cells with isolated SV40 particles, revealed that the frequency of retrotransposition was time-dependent. It was induced as early as 24 h, at 8.200-fold higher comparing to the natural retrotransposition frequency, increasing exponentially to high levels up to nine days post-infection. These data showed a direct correlation between SV40-cell transformation and VL30 retrotransposition and provided a strong evidence that SV40 large T antigen up-regulated the retrotransposition of VL30 elements. Studying the kinetics of VL30 retrotransposition in SV40-transformed cells we observed a time-dependent modulation of retrotransposition frequency in a biphasic fashion and massive cell death of retrotransposition-positive cells. Transfection of the recombinant VL30 reduced significantly the clonogenicity of SV40-transformed cells, but not that of normal NIH3T3 cells. Analysis of different retrotransposition-positive clones of SV40-transformed mouse cells revealed that retrotransposition-induced cell death was characterized by the simultaneous presence of typical hallmarks of various types of cell death. More importantly, we demonstrated that VL30 retrotransposition induced programmed cell death in a caspase independent and p53-dependent manner, via both p53 transcriptional-dependent and - independent death programmes leading to activation of the mitochondrial death pathway. In a next step, we asked whether human adenovirus, acting similarly as SV40 virus, could induce VL30 retrotransposition. Ectopic expression of both EIA and ElB55k adenoviral oncogenes induced retrotransposition frequency showing a correlation between adenovirus cell transformation and VL30 retrotransposition and confirming our previous findings with SV40 virus. In order to investigate the role of tumour suppressor protein p53 in regulating VL30 retrotransposition we used two established mouse cell lines, LM and LME6, expressing or not p53. We showed that while no retrotransposition events were evident in the presence of p53, its absense induced VL30 retrotransposition frequency at unusually high levels, correlating VL30 retrotransposition to p53 inactivation-mediated cellular transformation. To study the correlation between VL30 retrotransposition and Ras-Myc signalling axis mediated genomic instability, we initially used a mutant Ha-Ras gene. The expression of mutant Ha-RasV12 was not sufficient to induce VL30 retrotransposition events. Conversely, ectopic expression of C-myc or N-myc oncogenes induced retrotransposition frequency at high levels showing a correlation between the known Myc-induced cell transformation and VL30 retrotransposition. Using doxorubicin, as inducer of genomic instability, we demonstrated that doxorubicin induced VL30 retrotransposition frequency in a dose- and time-dependent manner, up to 483.000-fold higher than the natural retrotransposition frequency, and retrotransposition events were accompanied by cytotoxicity. Additionally, N-acetyl-cysteine reduced in a dose dependent manner retrotransposition frequency suggesting the involvement of oxidative stress in regulation of VL30 retrotransposition. In a final step, we showed that retrotransposition events could not be detected in the absense of an homologous reverse transcriptase probably lacking in human cells. More importantly, ectopic expression of a MoMLV-reverse transcriptase gene in assay cells produced retrotransposition events and suggested that factors used in the present study most likely acted through induction of expression of endogenous MoMLV or MoMLV-compatible reverse transcriptase genes. Our results provide strong evidence that the phenomena of retrotransposition and genomic instability are correlated.

Η ρύθμιση του φαινομένου της ρετρομετάθεσης παραμένει άγνωστη μέχρι σήμερα. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι διαφορετικές οικογένειες ρετροτρανσποζονίων, συμπεριλαμβανομένων και των στοιχείων VL30, ενεργοποιούνται μεταγραφικά αλλά και κινητοποιούνται σε καρκινικά κύτταρα, χαρακτηριστικό των οποίων είναι η γενωμική αστάθεια. Στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η συσχέτιση του φαινομένου της ρετρομετάθεσης των στοιχείων VL30 με την επαγόμενη γενωμική αστάθεια. Προς αυτή την κατεύθυνση κατασκευάσαμε: ένα ανασυνδυασμένο στοιχείο VL30 σημασμένο με ειδική κασσέττα ανίχνευσης και μέτρησης της ρετρομετάθεσης που βασίζεται στην έκφραση της πρωτεΐνης EGFP και ένα κυτταρικό μοντέλο μελέτης της ρετρομετάθεσης κυττάρων μυός ΝΙΗ3Τ3 σταθερά διαμολυσμένα με το ανασυνδυασμένο στοιχείο. Ανιχνεύσαμε και μετρήσαμε γεγονότα ρετρομετάθεσης μετά από διαμόλυνση του ανασυνδυασμένου στοιχείου στις μετασχηματισμένες από τον SV40 κυτταρικές σειρές μυός SVTT1 και Ca. Η επαγωγή της συχνότητας της ρετρομετάθεσης βρέθηκε σε υψηλά επίπεδα μόνο στα κύτταρα αυτά αλλά όχι σε φυσιολογικά κύτταρα ΝΙΗ3Τ3. Η εκτοπική έκφραση του αγρίου τύπου μεγάλου Τ αντιγόνου του SV40 ή του μεταλλαγμένου LE1135T, που δεν εκφράζει το μικρό t αντιγόνο, στο κυτταρικό μας μοντέλο επήγαγε τη ρετρομετάθεση σε υψηλές συχνότητες. Επιπλέον, μετά από μόλυνση με ιϊκά σωμάτια SV40 αποδείξαμε ότι η συχνότητα ρετρομετάθεσης επάγεται μόλις 24 ώρες μετά τη μόλυνση 8.200 φορές περισσότερο από τη αντίστοιχη φυσική και αυξάνεται εκθετικά σε υψηλά επίπεδα κατά χρονο-εξαρτώμενο τρόπο, συσχετίζοντας άμεσα τη ρετρομετάθεση των στοιχείων VL30 με τον επαγόμενο από τον SV40 κυτταρικό μετασχηματισμό. Μελετώντας την κινητική του φαινομένου σε κύτταρα μετασχηματισμένα από τον SV40, παρατηρήθηκε αφενός μεταβολή της συχνότητας ρετρομετάθεσης με την πάροδο του χρόνου που περιγράφεται από μία διφασική συνάρτηση και αφετέρου φαινόμενα μαζικού κυτταρικού θανάτου σε πληθυσμό θετικό σε ρετρομετάθεση. Παρατηρήσαμε ότι η διαμόλυνση του ανασυνδυασμένου VL30 μειώνει σημαντικά την κλωνογενετικότητα σε κύτταρα μετασχηματισμένα από τον SV40. Αναλύοντας μονήρεις κυτταρικούς κλώνους SVTT1 που εκφράζουν το ανασυνδυασμένο στοιχείο αποδείξαμε ότι η ρετρομετάθεση των στοιχείων VL30 επάγει κυτταρικό θάνατο, ο οποίος συνοδεύεται από την ταυτόχρονη παρουσία μορφολογικών χαρακτηριστικών διάφορων τύπων κυτταρικού θανάτου. Επιπρόσθετα, αποδείξαμε ότι ο επαγόμενος από ρετρομετάθεση των VL30 κυτταρικός θάνατος είναι ανεξάρτητος από την ενεργοποίηση κασπασών και εξαρτώμενος από την πρωτεΐνη p53, η οποία διαμέσω του μεταγραφικά-εξαρτώμενου και του μεταγραφικά-ανεξάρτητου προγράμματος της ενεργοποιεί τη μιτοχονδριακή πορεία θανάτου. Σε ένα επόμενο βήμα, χρησιμοποιήσαμε ως παράγοντα επαγωγής γενωμικής αστάθειας τον ανθρώπινο αδενοϊό. Η εκτοπική έκφραση αμφότερων των ογκογονιδίων EIA και E1B55k σε κύτταρα Pcl.10 επήγαγε τη συχνότητα ρετρομετάθεσης σε υψηλά επίπεδα, συσχετίζοντας τον επαγόμενο από τον αδενοϊό κυτταρικό μετασχηματισμό με τη ρετρομετάθεση και επιβεβαιώνοντας τις προηγούμενες παρατηρήσεις μας με τον ογκογόνο ιό SV40. Με σκοπό να διερευνήσουμε αν εμπλέκεται η ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη p53 στη ρύθμιση του φαινομένου χρησιμοποιήσαμε τις κυτταρικές σειρές μυός LM και LME6. Μετά από διαμόλυνση του ανασυνδυασμένου στοιχείου αποδείξαμε ότι παρουσία της ογκοκατασταλτικής πρωτεΐνης p53 (κύτταρα LM) δεν ανιχνεύονται γεγονότα ρετρομετάθεσης. Αντίθετα, η απουσία της (κύτταρα LME6) οδηγεί στην επαγωγή της συχνότητας ρετρομετάθεσης σε ασυνήθιστα υψηλά επίπεδα συσχετίζοντας τη ρετρομετάθεση με τον επαγόμενο, από απώλεια της δράσης της p53, κυτταρικό μετασχηματισμό. Ακολούθως, μελετήσαμε αν η επαγόμενη, από τον σηματοδοτικό άξονα των ογκογονιδίων Ras-Myc, γενωμική αστάθεια συσχετίζεται με την επαγωγή του φαινομένου της ρετρομετάθεσης. Αποδείξαμε ότι η σηματοδότηση του μεταλλαγμένου γονιδίου Ha-RasV12 δεν αποτελεί ικανή συνθήκη πραγματοποίησης γεγονότων ρετρομετάθεσης. Αντίθετα, η εκτοπική έκφραση αμφότερων των ογκογονιδίων C-myc ή N-myc επήγαγε τη συχνότητα ρετρομετάθεσης σε υψηλά επίπεδα, συσχετίζοντας τη ρετρομετάθεση με τον επαγόμενο από Myc κυτταρικό μετασχηματισμό. Χρησιμοποιώντας τη δοξορουβικίνη, ως παράγοντα επαγωγής γενωμικής αστάθειας και κυτταρικού θανάτου, αποδείξαμε ότι η συχνότητα ρετρομετάθεσης των VL30 επάγεται κατά δοσο- και χρονο-εξαρτώμενο τρόπο σε ασυνήθιστα υψηλά επίπεδα, φτάνοντας περίπου 483.000 φορές περισσότερο από τη φυσική συχνότητα, ενώ τα επαγόμενα γεγονότα ρετρομετάθεσης συνοδεύονταν από κυτταροτοξικά φαινόμενα. Επιπλέον, αποδείχθηκε ότι η Ν-ακετυλο-κυστεΐνη αναστέλλει κατά δοσο-εξαρτώμενο τρόπο την επαγόμενη από δοξορουβικίνη ρετρομετάθεση, γεγονός που υποδεικνύει την εμπλοκή του οξειδωτικού στρες στο μηχανισμό ρύθμισης του φαινομένου. Σε ένα τελικό στάδιο, αποδείξαμε ότι η απουσία ομόλογης αντίστροφης μεταγραφάσης, που πιθανώς λείπει σε ανθρώπινα κύτταρα, καθιστά αδύνατη την πραγματοποίηση γεγονότων ρετρομετάθεσης. Αντίθετα, η εκτοπική έκφραση ενός γονιδίου αντίστροφης μεταγραφάσης του MoMLV παρήγαγε γεγονότα ρετρομετάθεσης του ανασυνδυασμένου VL30, υποδηλώνοντας ότι οι προαναφερόμενοι παράγοντες πιθανώς επάγουν την έκφραση των ενδογενών γονιδίων αντιστρόφων μεταγραφασών του MoMLV ή άλλων συμβατών με αυτές. Καταλήγοντας, τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης στο σύνολό τους αποδεικνύουν τη άμεση συσχέτιση του φαινομένου της ρετρομετάθεσης με την επαγόμενη γενωμική αστάθεια.