Αναλύσεις υβριδισμού νουκλεϊκών οξέων με νανοσωματίδια

Abstract

This doctoral thesis is focused on the exploitation of dry-reagent rapid tests (dipsticks) in nucleic acid analysis that combines the highly specific recognition properties of oligonucleotides with the unique optical properties of gold nanoparticles. The dry-reagent rapid tests are suitable for “point-of-care” applications, for the detection of amplified nucleic acid products, as well as for the detection of polymorphisms/mutations of genes. The theoretical part of this thesis consists of 4 chapters. Chapter 1 describes the unique properties of nanoparticles and especially those of gold nanoparticles (ΑuNPs). The bright red color of ΑuNPs is due to the plasmon resonance peak at 520 nm. The functionalization of ΑuNPs with biomolecular recognition motif provides flexibility for a variety of applications. Chapter 2 focuses on dry-reagent dipstick assays using colored nano/microparticles as reporters and their applications in nucleic acids analysis. Chapter 3 refers to farmacogenetics and farmacogenomics that deal with the cross-correlation of polymorphisms presented in genes encoding drug-metabolizing enzymes, with the response of organism in drugs. Chapter 4 describes the genes under study of this thesis, the role and their importance. The experimental part of this thesis consists of 5 chapters. Instrumentation, reagents and methods that were used in the experimental part, are described in chapter 5. Chapter 6 describes the development of rapid method for the detection of polymorphisms of genes encoding drug-metabolizing enzymes. Method is based on the detection of PEXT reaction products with dry-reagent dipstick assays. The proposed PEXT-dipstick assay involves exponential amplification of the genomic region that spans the SNP of interest, two PEXT reactions using allele-specific primers and detection with dry-reagent dipsticks that include one test zone. The method was used for genotyping of basic polymorphisms in genes CYP2D6, CYP2C19 and TPMT. Patient samples (76 variants in total) were genotyped and the results were fully concordant with those obtained by direct DNA sequencing. Chapter 7 describes the exploitation of latex colored particles as reporters for visual detection of nucleic acid sequences based on dry-reagent dipstick tests. Compared to gold nanoparticles, latex microspheres can be manufactured in any colour and with a wide variety of surface modifications. Latex microspheres were used as labels for the detection of 225-bp fragment of maize reference gene Invertase (IVR) and for the genotyping of MBL2 gene (polymorphisms -550 and -221). Comparison study with gold nanoparticles as labels shows similar detectability (2.5 fmol PCR product for red latex particles and gold particles, 0.8 fmol PCR product for blue latex particles), useful analytical range up to 70 fmol for all the particles and very satisfying reproducibility for the detection of nucleic acids, while they can be used for genotyping polymorphisms, detecting PEXT products. ..................

Στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής περιγράφεται η αξιοποίηση των ταινιών ξηρών αντιδραστηρίων στην ανάλυση των νουκλεϊκών οξέων, οι οποίες συνδυάζουν την ειδική υβριδοποίηση συμπληρωματικών ολιγονουκλεοτιδίων με την οπτική ανίχνευση με νανοσφαιρίδια χρυσού. Οι ταινίες ξηρών αντιδραστηρίων είναι κατάλληλες για «point-of-care» εφαρμογές, για την ανίχνευση προϊόντων ενίσχυσης νουκλεϊκών οξέων, καθώς και την ανίχνευση πολυμορφισμών/μεταλλάξεων των γονιδίων. Το θεωρητικό μέρος της διατριβής αποτελειται από 4 κεφάλαια. Στο κεφάλαιο 1 περιγράφονται οι μοναδικές ιδιότητες των νανοσωματιδίων και ιδιαίτερα των νανοσφαιριδίων χρυσού. Τα νανοσφαιρίδια χρυσού παρουσιάζουν έντονο κόκκινο χρώμα που οφείλεται στο συντονισμό των επιφανειακών πλασμονίων, στα 520 nm. Με σύζευξη των νανοσφαιριδίων με βιομόρια είναι δυνατή η αξιοποίησή τους στην ανάλυση νουκλεϊκών οξέων. Στο κεφάλαιο περιγράφονται επίσης ορισμένες εφαρμογές τους. Το κεφάλαιο 2 αναφέρεται στις ταινίες ξηρών αντιδραστηρίων με τη χρήση έγχρωμων νανο/μικροσφαιριδίων και οι εφαρμογές τους στην ανάλυση των νουκλεϊκών οξέων. Το κεφάλαιο 3 αναφέρεται στη φαρμακογενετική και τη φαρμακογενωμική, αντικείμενο των οποίων είναι η συσχέτιση των πολυμορφισμών που παρουσιάζονται σε γονίδια που συμμετέχουν στο μεταβολισμό φαρμάκων, με την απόκριση του οργανισμού στα φάρμακα. Στο κεφάλαιο 4 περιγράφονται τα γονίδια-στόχοι, ο ρόλος και η σημασία τους. Το πειραματικό μέρος του διδακτορικού αποτελείται από 5 κεφάλαια. Στο κεφάλαιο 5 περιγράφεται η οργανολογία, τα αντιδραστήρια και οι μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν στο πειραματικό μέρος. Στο κεφάλαιο 6 περιγράφεται η ανάπτυξη ταχείας μεθόδου προσδιορισμού πολυμορφισμών σε γονίδια που επιδρούν στο μεταβολισμό φαρμάκων. Η μέθοδος βασίζεται στην ανίχνευση των προϊόντων της γονοτυπικής αντίδρασης PEXT με ταινία ξηρών αντιδραστηρίων. Η προτεινόμενη μέθοδος περιλαμβάνει εκθετική ενίσχυση με PCR, της περιοχής του γονιδίου που περιέχει το σημειακό πολυμορφισμό, δύο αντιδράσεις PEXT χρησιμοποιώντας αλληλο-ειδικούς εκκινητές, και δοκιμασία με ταινία ξηρών αντιδραστηρίων μιας ζώνης δοκιμασίας. Η ταινία ξηρών αντιδραστηρίων χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση βασικών πολυμορφισμών στα γονίδια CYP2D6, CYP2C19 και TPMT και συνολικά πραγματοποιήθηκαν 76 γονοτυπικοί προσδιορισμοί. Τα αποτελέσματα ήταν σε πλήρη συμφωνία με αυτά που προέκυψαν έπειτα από αλληλούχιση DNA. Στο κεφάλαιο 7 περιγράφεται η αξιοποίηση έγχρωμων μικροσφαιριδίων πολυστυρενίου ως ιχνηθετών σε ταινίες ξηρών αντιδραστηρίων. Τα σφαιρίδια πολυστυρενίου διατίθενται στο εμπόριο τροποποιημένα με ποικιλία χαρακτηριστικών ομάδων και η σύζευξη τους με ειδικά ολιγονουκλεοτίδια πραγματοποιείται ομοιοπολικά με τη βοήθεια ειδικών αντιδραστηρίων και κατάλληλα τροποποιημένων ολιγονουκλεοτιδίων. ...............................