Αξιολόγηση της παρασίτωσης από blastocystis hominis και μελέτη των γονοτύπων των στελεχών

Abstract

Introduction. Blastocystis hominis is a common polymorphic intestinal protozoan in humans. Pathogenic and non-pathogenic subtype existence is still under investigation. Materials and methods. A simplified medium consisted of 2.5 ml agar slant and Stone’s modification of Locke’s solution supplemented with 20% peptone and 30% heat-inactivated horse serum, giving a complete medium volume of 6.5 ml, was newly developed. A PCR-based assay used single strand conformation polymorphism (SSCP)/sequencing to detect Blastocystis both directly from human faeces and in parasitic cultures. Mixed infections with Blastocystis and other enteric parasites were microscopically excluded. Xenic cultures (with rice starch) were used to confirm single infections and examine Blastocystis morphology. Using cultivation and PCR-SSCP, parasite’s genotype/phenotype association was explored among immunocompetent individuals with Blastocystis alone in regards to possible clinical symptoms. Results. The new medium was used to cultivate 25 positive and 20 negative for Blastocystis samples. In comparison to Robinson’s medium, an established biphasic medium, it proved to be equally capable of isolating Blastocystis and checking amoeboid presence. Its potential use in Blastocystis maintenance was speculated. The PCR-SSCP method was applied to 45 positive and 30 negative for Blastocystis faecal samples and proved to be highly sensitive and specific. This protocol could classify Blastocystis among the nine established subtypes. Of 1,913 faecal specimens, Blastocystis infection rate was microscopically estimated at 3.5% in a Greek population. Thirty-two strains, isolated from asymptomatic single-infected individuals, presented only vacuolar (and granular) forms during culture. In 50% of these, subtypes 1, 2, and 7 were found; in the remaining 50%, subtype 3 was identified. Subtype 3 was also detected in 12 mono-infected patients with minor chronic gastrointestinal symptoms. One patient with acute urticarial lesions together with minor gastrointestinal symptoms was infested with Blastocystis sp. subtype 3 additionally producing amoeboid forms throughout cultivation. Likewise amoeboid Blastocystis appeared in cultures of 11/12 symptomatic subtype-3 isolates. In symptomatic isolates, amoeboid forms were discriminated from other forms and irregular Blastocystis, with plasmotomy having possibly been seen. A subtype-4 strain presented as amoeboid was isolated from a symptomatic patient. Conclusion. Simple PCR-SSCP method might contribute towards studies on Blastocystis molecular epidemiology and clinical importance. An amoeboid symptomatic subtype-4 isolate was firstly identified. There was a difference in morphology between subtype-3 asymptomatic and symptomatic isolates. Thus, potential pathogenic role of the preponderant human subtype 3 (or clone) presenting as amoeboid in cultivation could be suggested. Currently, amoeboid presence checking in short-term cultures using biphasic medium such as the user-friendly alternative simplified medium might provide a simple diagnostic tool to screen patients suffering from clinical symptoms related to parasite for potential pathogenic Blastocystis subtype or clone.

Εισαγωγή. Η Blastocystis hominis, πρωτόζωο του εντέρου που εμφανίζει διάφορες μορφές, ανιχεύεται συχνά στους ανθρώπους. Το ενδεχόμενο παθογόνων και μη παθογόνων υποτύπων διερευνάται. Υλικά και μέθοδοι. Αναπτύξαμε νέο, απλούστερο υλικό από 2,5 ml κεκλιμένο άγαρ και τροποποιημένο κατά Stone διάλυμα του Locke με 20% πεπτόνη και 30% ορό ίππου θερμικά αδρανοποιημένου με τελικό όγκο 6,5 ml. Για την ανίχνευση Blastocystis απευθείας από δείγματα κοπράνων, αλλά και από καλλιέργειες, χρησιμοποιήθηκε PCR σε συνδυασμό με ανάλυση πολυμορφισμού διαμόρφωσης μονόκλωνου DNA [single strand conformation polymprphism (SSCP)] και ανάλυση νουκλεοτιδικής αλληλουχίας. Οι συλλοιμώξεις με παράσιτα του εντέρου αποκλείσθηκαν με παρασιτολογική εξέταση. Με ξενικές καλλιέργειες (προσθήκη αμύλου ορύζης) επιβεβαιώθηκαν οι μονοπαρασιτώσεις από Blastocystis και εξετάσθηκε η μορφολογία της. Με καλλιέργειες και PCR-SSCP μελετήθηκε η συσχέτιση γονοτύπων/φαινοτυπικών χαρακτηριστικών του παρασίτου σε άτομα ανοσοεπαρκή που είχαν μόνο Blastocystis. Αποτελέσματα. Το νέο υλικό χρησιμοποιήθηκε για καλλιέργεια 25 θετικών και 20 αρνητικών για Blastocystis δείγματα. Σε σύγκριση με το υλικό του Robinson, ένα καθιερωμένο καλλιεργητικό υλικό δύο φάσεων, βρέθηκε εφάμιλλο ως προς την απομόνωση και τον έλεγχο της παρουσίας αμοιβαδοειδών μορφών. Φάνηκε ότι θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για διατήρηση της Blastocystis. Με PCR-SSCP, που εφαρμόσθηκε σε 45 θετικά και 30 αρνητικά για Blastocystis δείγματα κοπράνων και αποδείχθηκε πολύ ευαίσθητη και ειδική, κατέστη δυνατή η ταξινόμηση Blastocystis στους εννέα καθιερωμένους υποτύπους. Το ποσοστό της παρασίτωσης από Blastocystis εκτιμήθηκε με μικροσκόπηση 1913 δειγμάτων κοπράνων στο 3,5% του πληθυσμού που εξετάσαμε στην Ελλάδα. Τα 32 στελέχη που απομονώθηκαν από ασυμπτωματικά ατόμα με μονοπαρασίτωση παρουσίασαν μόνο κενοτοπιώδεις (και κοκκιώδεις) μορφές στις καλλιέργειές τους, το 50% άνηκε στους υποτύπους 1, 2 και 7, ενώ στο υπόλοιπο 50% βρέθηκε υπότυπος 3. Ο υπότυπος 3 ανιχνεύθηκε, επίσης, σε 12 ασθενείς με μονοπαρασίτωση και ήπια χρόνια γαστρεντερικά συμπτώματα. Σε ένα ασθενή που εκδήλωσε οξεία κνίδωση και ήπια γαστρεντερικά συμπτώματα το στέλεχος ταυτοποιήθηκε ως υπότυπος 3 της Blastocystis sp. και παρήγαγε αμοιβαδοειδείς μορφές στην καλλιέργεια. Αμοιβαδοειδείς Blastocystis παρατηρήθηκαν παρομοίως στις καλλιέργειες 11/12 συμπτωματικών στελεχών του υποτύπου 3. Στα συμπτωματικά στελέχη διακρίναμε αμοιβαδοειδείς από άλλες μορφές και Blastocystis χωρίς συγκεκριμένο σχήμα, αλλά και ενδεχόμενη κατάτμηση του κυτταροπλάσματος των αμοιβαδοειδών. Σε ένα ασθενή απομονώσαμε στέλεχος υποτύπου 4 που παρουσιάσθηκε ως αμοιβαδοειδής. Συμπέρασμα. Η PCR-SSCP συμβάλλει, ως μέθοδος απλή, σε μελέτες μοριακής επιδημιολογίας και κλινικής σημασίας της Blastocystis. Πρώτη φορά αναφέρθηκε εμφάνιση αμοιβαδοειδών μορφών σε συμπτωματικό στελέχος υποτύπου 4. Η μορφολογία διέφερε μεταξύ ασυμπτωματικών και συμπτωματικών στελεχών του υποτύπου 3. Συνεπώς, ενδέχεται ο κατ’εξοχήν γονότυπος του ανθρώπου, ο υποτύπος 3 (ή στελέχη του), που παρουσιάζει αμοιβαδοειδείς μορφές στις καλλιέργειες να είναι παθογόνος. Είναι δυνατό, προς το παρόν, με αναζήτηση αμοιβαδοειδών μορφών σε υλικό δύο φάσεων, όπως το απλοποιημένο, να γίνεται απλά ο έλεγχος ασθενών με συμπτώματα σχετιζόμενα με Blastocystis για δυνητικά παθογόνους υποτύπους ή στελέχη.