Μελέτες πρωτεϊνικής σύνθεσης με χρήση οπτικών λαβίδων και μονομοριακού FRET

Abstract

In the first part of the thesis, ribosomes unspecifically labeled with the fluorescent dye Atto655 were tethered onto SiO₂ beads covered with streptavidin. The ribosomes were tethered via protein L4, which was biotinylated in vivo and incorporated into the ribosomes. The ribosomes tethered onto the beads were used for experiments with optical tweezers. The ribosomes synthesized the proteins GFPem and ubiquitin on a bead by adding an in vitro transcription-translation mix without histidine, in order to stop synthesis in a His-tag. The N-terminus of the proteins, which was biotinylated during synthesis using the suppressor tRNA technique, was barely sticking out of the ribosomal tunnel and it was accessible to bind via streptavidin to a polystyrene bead, which was trapped with the optical tweezers. With the optical tweezers it was possible to measure forces in a pN scale. It was shown that in order to keep a steady hook-up, a force lower than 10 pN should be applied, since higher forces lead to a rupture. The next step would be to continue synthesis of the protein and determine the forces applied on the polypeptide chain during synthesis. In the second part of the thesis, the same kind of ribosomes, unspecifically labeled with the dye Atto655, were tethered onto surfaces via the biotinylated protein L4. These ribosomes were detected on the surface due to their fluorescence using a wide field microscope and they were able to produce a fully active GFPem protein in situ. The protein was modified in order to remain attached to the ribosome after synthesis and it was detected due to its intrinsic fluorescence. Time resolved measurements were made and the time of appearance of fully active GFPem proteins synthesized by single ribosomes was observed. Surface tethering of specifically labeled ribosomes on protein L24 or L29 with the dye Alexa633 (acceptor) followed. These ribosomes synthesized protein GFPem, where the dye BODIPY-TMR (donor) was incorporated during synthesis using the suppressor tRNA technique. During the experiments, the donor was excited at certain times but both donor and acceptor were detected. Synthesis was stopped again in a His-tag, immediately after the incorporation of BODIPY-TMR. At this point, the two dyes were 111 Å apart, quite far away to observe FRET. But by continuing synthesis, the appearance of some acceptor fluorescence was observed, exclusively due to FRET. The next step would be to determine exactly the fluorescence intensities of both dyes in a time resolved manner and calculate the distances between them. After that a first impression of how the protein folds co-translationally could be given.

Στο πρώτο μέρος της διατριβής, ριβοσώματα μη ειδικά σημασμένα με το φθορισμοφόρο Atto655 συνδέθηκαν σε χάντρες SiO₂ επικαλυμμένες με στρεπταβιδίνη. Η σύνδεση έγινε μέσω της ριβοσωμικής πρωτεΐνης L4, η οποία βιοτινυλιώθηκε in vivo και κατόπιν ενσωματώθηκε στα ριβοσώματα. Οι χάντρες SiO₂ με τα συνδεδεμένα ριβοσώματα χρησιμοποιήθηκαν για πειράματα με οπτικές λαβίδες. Τα ριβοσώματα συνέθεσαν τις πρωτεΐνες GFPem και ουβικιτίνη πάνω σε μία χάντρα με την εισαγωγή ενός μίγματος in vitro μεταγραφής-μετάφρασης, το οποίο δεν περιείχε το αμινοξύ ιστιδίνη, ώστε να σταματάει η σύνθεση σε μία ουρά έξι ιστιδινών. Το αμινοτελικό άκρο των πρωτεϊνών, το οποίο είχε βιοτινυλιωθεί κατά την σύνθεση με την τεχνική του κατασταλτικού tRNA, ξεπρόβαλε από το κανάλι του ριβοσώματος και ήταν προσβάσιμο για να συνδεθεί μέσω στρεπταβιδίνης σε μία χάντρα πολυστυρενίου, η οποία ήταν παγιδευμένη στις οπτικές λαβίδες. Με τις οπτικές λαβίδες κατέστη δυνατό να μετρηθούν δυνάμεις στην κλίμακα των pN. Αποδείχθηκε ότι απαιτείται δύναμη μικρότερη των 10 pN, ώστε να διατηρηθεί ανέπαφη η σύνδεση του συστήματος, καθώς με εφαρμογή μεγαλύτερης δύναμης παρατηρήθηκε ρήξη της σύνδεσης. Το επόμενο βήμα θα ήταν να συνεχιστεί η σύνθεση της πρωτεΐνης και να προσδιοριστούν οι δυνάμεις που ασκούνται στην πολυπεπτιδική αλυσίδα κατά τη διάρκεια της σύνθεσης. Στο δεύτερο μέρος της διατριβής, τα ίδια ριβοσώματα μη ειδικά σημασμένα με το φθορισμοφόρο Atto655 συνδέθηκαν πάνω σε επιφάνειες μέσω της βιοτινυλιωμένης πρωτεΐνης L4. Τα ριβοσώματα αυτά ανιχνεύθηκαν πάνω στην επιφάνεια λόγω του φθορισμού τους με ένα μικροσκόπιο ευρέως φάσματος και ήταν ικανά να συνθέσουν, in situ πάνω στο μικροσκόπιο, πλήρως λειτουργική πρωτεΐνη GFPem. Η πρωτεΐνη είχε τροποποιηθεί κατάλληλα ώστε να παραμένει προσκολλημένη στο ριβόσωμα μετά το τέλος της σύνθεσης και ανιχνεύθηκε λόγω του ενδογενούς φθορισμού της. Με το σύστημα αυτό έγινε δυνατή η παρατήρηση των χρόνων εμφάνισης πλήρως λειτουργικών πρωτεϊνών GFPem από μεμονωμένα ριβοσώματα. Ακολούθησε η σύνδεση στις επιφάνειες αυτή τη φορά ριβοσωμάτων ειδικά σημασμένων είτε στην πρωτεΐνη L24 είτε στην πρωτεΐνη L29 με το φθορισμοφόρο Alexa633 (δέκτης). Τα ριβοσώματα αυτά συνέθεσαν την πρωτεΐνη GFPem, στην οποία εισήχθη το φθορισμοφόρο BODIPY-TMR (δότης) κατά την διάρκεια της σύνθεσης με την τεχνική του κατασταλτικού tRNA. Κατά τη διάρκεια των πειραμάτων, γινόταν διέγερση μόνο του δότη ανά τακτά χρονικά διαστήματα αλλά ανίχνευση του φθορισμού και του δότη και του δέκτη. Η σύνθεση σταμάτησε και πάλι σε μία ουρά έξι ιστιδινών, αμέσως μετά την εισαγωγή του BODIPY-TMR. Σε αυτό το σημείο τα φθορισμοφόρα απείχαν μεταξύ τους 111 Å, απόσταση αρκετά μακρινή και δεν παρατηρήθηκε FRET. Με την επανέναρξη, όμως, της σύνθεσης, παρατηρήθηκε ότι κάποιοι από τους δέκτες άρχισαν να φθορίζουν, γεγονός που οφειλόταν αποκλειστικά στο φαινόμενο του FRET. Το επόμενο βήμα θα ήταν να προσδιοριστούν επακριβώς οι εντάσεις φθορισμού των δύο φθορισμοφόρων για κάθε χρονική στιγμή, ώστε να υπολογιστούν οι αποστάσεις μεταξύ τους και να δοθεί μία πρώτη εντύπωση για το πως αναδιπλώνεται η πρωτεΐνη κατά τη διάρκεια της σύνθεσής της.