Μοριακοί καρκινικοί δείκτες σε όγκους του παχέος εντέρου, καρκίνο του μαστού και προστατικές νεοπλασίες: ανίχνευση γυμνού DNA και RNA στο πλάσμα, μεθυλίωση και ο ρόλος των πρωτεϊνών 14-3-3

Abstract

Scope: In this study we examined several molecular markers in cancer patients and in normal individuals. The present study was focused in the study of molecular markers in the diagnosis of various neoplasias such as brain tumors, prostate, breast and gastric cancers. The markers tested were: 1. RNA markers: a. PSMA mRNA in blood samples ofprostate cancer patients. b. CEA mRNA in blood samples ofprostate and gastric cancer patients. c. 14-3-3σ mRNA in patients with lung, breast and prostate cancer as well as in leukemias. 2. DNA markers: a. DNA quantification in plasma samples of patients with prostate, breast and gastric cancer. b. Méthylation status in the promoter region ofthe following genes: I. MGMT II. 14-3-30 III. GSTP1 IV. RASSFla V. ATM. The méthylation pattern ofthese genes was tested in tissues and/or peripheral blood of cancer patients. Methods: DNA quantification in plasma was performed using real-time PCR and the DNA DipStick™ Kit. We then assessed the méthylation status ofMGMT, 14-3-3o and GSTP1 in plasma DNA using MSP (Methylation-specific PCR) assay, while the méthylation status ofRASSF1A and ATM genes was examined by the MethyLight technology. RT-PCR analysis was used for the detection of PSMA and CEA RNA. Results: DNA molecular markers were detected in increased percentages of cancerpatients. Important rates of detection were observed for the quantification of DNA in plasma and for the méthylation status of GSTP1, RASSF1A και ATM genes. 58.3% of newly diagnosed prostate cancer patients and 26.7% of prostate cancer patients under therapy had increased plasma DNA levels. Additionally, 48.5% of breast cancer patients showed plasma DNA levels above the cut-off limit. GSTP1 promoter hyperméthylation was detectable in 75% of plasma samples obtained from patients with newly diagnosed prostate cancer and in 36.8% ofpatients under therapy, whereas26% and 14% of the breast cancer patients tested were positive for RASSF1A and ATM méthylation respectively. Detection of RNA molecular markers was found in smaller percentages in the blood of cancer patients. Conclusion: The combination of DNA load and genes promoter méthylation statuscould be a new non invasive approach for early detection of both prostate and breast cancer.

Σκοπός: Τα εξωκυτταρικά νουκλεϊνικά οξέα θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως μοριακοί δείκτες στην έγκαιρη ανίχνευση του καρκίνου και στην πρόβλεψη της έκβασης της νόσου. Η παρούσα διδακτορική διατριβή επικεντρώθηκε στη μελέτη της χρησιμότητας των μοριακών δεικτών στην διάγνωση διαφόρων νεοπλασιών όπως οι καρκίνοι του προστάτη, του μαστού και του γαστρεντερικού συστήματος. Μελετήθηκαν οι εξής καρκινικοί δείκτες: 1. RNA δείκτες: a. PSMA mRNA στο αίμα ασθενών με καρκίνο του προστάτη. b. CEA mRNA στο αίμα ασθενών με νεοπλασίες του γαστρεντερικού συστήματος και του προστάτη. c. Ανίχνευση mRNA του 14-3-3σ σε ασθενείς με καρκίνους του πνεύμονα, μαστού, προστάτη και σε λευχαιμίες. 2. DNA δείκτες: a. Ποσοτικοποίηση του φορτίου DNA στο πλάσμα ασθενών με καρκίνο του προστάτη, του μαστού και του γαστρεντερικού συστήματος. b. Ανίχνευση της μεθυλίωσης στους υποκινητές των γονιδίων: I. MGMT II. 14-3-3σ III. GSTP1 IV. RASSFla V. ATM. Η μεθυλίωση στα παραπάνω γονίδια μελετήθηκε σε περιφερικό αίμα ή/και ιστούς ασθενών με καρκίνο. Μέθοδοι: To DNA πλάσμιατος ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο PCR πραγματικού χρόνου (Real Time PCR) καθώς και τη τυποποιημένη συσκευασία δοκιμασίας DNA DipStick™. Ελέγχθηκε επίσης η μεθυλίωση των γονιδίων MGMT, 14-3-3σ και GSTP1 χρησιμοποιώντας την ειδική για τη μεθυλίωση PCR (MéthylationSpecific PCR ή MSP), ενώ η μεθυλίωση στα γονίδια RASSF1A και του ATM στο πλάσμα ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας τη τεχνολογία MethyLight. Η μέθοδος RT-PCR χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση των PSMA και CEA mRNA. Αποτελέσματα: Οι DNA μοριακοί δείκτες ανιχνεύθηκαν σε αυξημένα ποσοστά ασθενών με καρκίνο. Σημαντικά ποσοστά ανίχνευσης παρατηρήθηκαν για τη ποσοτικοποίηση του DNA στο πλάσμα και για την μεθυλίωση στα γονίδια GSTP1, RASSF1A και ATM. Πιο συγκεκριμένα, στο 58.3% των ασθενών με πρόσφατα διαγνωσθέντα καρκίνο του προστάτη και στο 21% των ασθενών υπό θεραπεία, παρατηρήθηκε αύξηση της συγκέντρωσης του DNA στο πλάσμα. Επιπλέον, το 48.5% των ασθενών με καρκίνο του μαστού και το 62.5% των ασθενών με καρκίνο γαστρεντερικού συστήματος παρουσίασαν αυξημένες τιμές στο εξωκυτταρικό DNA.Υπερμεθυλίωση στον υποκινητή του γονιδίου GSTP1 ανιχνεύθηκε στο 75% των δειγμάτων πλάσματος που λήφθηκαν από ασθενείς με πρόσφατα διαγνωσθέντα καρκίνο του προστάτη και στο 37% των ασθενών υπό θεραπεία. Υπερμεθυλίωση στους υποκινητές των γονιδίων RASSF1A και ATM παρατηρήθηκε στο 26% και 14% αντίστοιχα των ασθενών με καρκίνο μαστού. Ανίχνευση RNA μοριακών δεικτών βρέθηκε σε μικρότερα ποσοστά στο αίμα ασθενών με καρκίνο. Συμπέρασμα: Ο συνδυασμός της μέτρησης του φορτίου DNA και της ανάλυσης της μεθυλίωσης στους υποκινητές γονιδίων θα μπορούσε να είναι μία νέα μη επεμβατική προσέγγιση για την πρώιμη ανίχνευση του καρκίνου του προστάτη και του μαστού.