Η αντοχή των εγχώριων ποικιλιών φασολιάς στην ανθράκωση (Colletotrichum lindemuthianum) και η επίδραση βακτηρίων της ριζόσφαιρας στην ασθένεια

Abstract

Thirty five Colletotrichum lindemuthianum isolates were obtained from bean (Phaseolus vulgaris) fields in 23 Prefectures of Greece during a survey conducted in 2003 and 2004. Bean anthracnose site of infections were found only in three of the surveyed Prefectures (Prefecture of Kavala Municipality of Hrisoupolis, Prefecture of Serres Municipality of Vrodou, Prefecture of Drama Municipality of Nevrokopi). Race characterization based on the standardized set of 12 differential cultivars demonstrated the presence of race 2, 6, and 22, which are reported for first time in Greece, while race 22 is reported for the first time in the world. In addition, pathotype diversity showed significant correlation with the geographical origin of these isolates. All three races caused disease symptoms only on cultivars with Andean origin, suggesting that Greek isolates originated from South American countries. Assessment of colony diameter, sporulation and germination of conidia, of the specific isolates, in several temperatures, revealed significant differences between the three places of their origin. In addition there were no significant differences between isolates which were obtained from the same area. Isolates originated from Prefectures of Serres and Drama showed grater values of colony growth, sporulation and germination of conidia, when tested in low temperatures (12° and 18°C), comparing with those from Prefecture of Kavala, which showed grater growth rates on 24°C. Virulence spectrum of the above C. lindemuthianum isolates was also examined on a set of 30 local cultivars, showing seven types of virulence, complementing the data concerning greek C. lindemuthianum population variability. Based on their reactions to the pathogen isolates, Greek cultivars were divided into nine groups. Among these cultivars two (Ithomi FS60 and Larisa) were resistant to all tested isolates, including the reference isolates. Random amplified polymorphic DNA (RAPDs), restriction fragment length polymorphism (RFLP), random amplified DNA microsatellites (RAM) and PCR based on repeated sequences analysis (ERIC - BOX PCR) revealed the existence of two main groups between the greek C. lindemuthianum isolates. More specific, pathogen’s isolates were divided, through RAPDs analysis, into two main groups (group1: BV1 - BV17, BN1, BN3 - BN8, BN10 - BN12, BN14 - BN16, BH1, BH2, group2: BN2, BN9, BN13, UPS2, UPS36S), showing that there were genetic similarity between 91% of the tested greek isolates. Ribosomal DNA analysis (RFLP) showed similar results with the exception of one’s isolate grouping (BN2 isolate belonged to group1). In that case genetic similarities were found between 94% of the tested greek isolates. RAM and ERIC - BOX PCR analysis, which deal with the whole genome as RAPDs analysis does so, revealed data were in agreement with RAPDs results, grouping in the same (RAM) or in a similar way (ERIC - BOX PCR) the tested isolates and showing grate correlation values (correlation between RAMs and RAPDs analysis: r = 0,71, p = 0,05, correlation between ERIC - BOX PCR and RAPDs analysis: r = 0,49, p = 0,05, correlation between RAM and ERIC - BOX PCR analysis: r = 0,58, p = 0,05). In conclusion, the results of all the used techniques showed that the grate majority of the greek C. lindemuthianum isolates belonged to the same genetic similarity group, indicating that Greek isolates have genotypic similarities. Pseudomonas chlororaphis PCL1391 and Pseudomonas fluorescens WCS365 were tested, in vitro and in planta, for their control efficacy of three C. lindemuthianum races presented in Greece. In vitro experiments showed that P. chlororaphis PCL1391 reduced growth, sporulation and conidial germinability for the tested races of the pathogen. Similar results were obtained when both bacteria were used in combination. In contrast, P. fluorescens WCS365, when treated alone, did not affect any of the assessed fungal characteristics. It was assumed that the production of phenazine - 1 - carbixiamide, a known antifungal metabolite of P. chlororaphis PCL1391, was the crucial factor for the in vitro activity o this strain. This hypothesis was tested and confirmed by absence of fungal growth over PCN on a seeded lind TLC plate. Colonization experiments showed that P. chlororaphis PCL1391 and P. fluorescens WCS365 are excellent colonizers of bean root tip. In addition, their combined treatment resulted in an increased concentration of the total bacterial population on the root tips and a reduction of the P. fluorescens WCS365 population. P. chlororaphis PCL 1391, in the absence and in the presence of the three fungal races, promoted several plant growth characteristics. Moreover the promoted effect was even greater when the above strain was tested combined with P. fluorescens WCS365. On the other hand, treatment with P. fluorescens WCS365 resulted in minor differentiations of the specific growth characteristics. Effect on disease severity experiments showed that combined treatments resulted in best control results for all the tested races, P. chlororaphis PCL1391 treatment was following in control efficacy, while P. fluorescens WCS365 treated plants showed no significant differences compared to positive control.

Κατά τη διάρκεια των ετών 2003 και 2004 πραγματοποιήθηκε σε 23 Νομούς της Ελλάδας επισκόπηση προσβεβλημένων από την ασθένεια της ανθράκωσης φυτών φασολιού. Ο μύκητας Colletotrichum lindemuthianum εντοπίσθηκε στους Νομούς Καβάλας, Σερρών και Δράμας, από όπου συλλέχθηκαν 35 απομονώσεις του. Η μελέτη των βιολογικών χαρακτηριστικών φανέρωσε την ύπαρξη παραλλακτικότητας μεταξύ των πληθυσμών των τριών διαφορετικών περιοχών, ενώ οι διαφοροποιήσεις μεταξύ απομονώσεων της αυτής προέλευσης ήταν ελάχιστες. Οι απομονώσεις που προήλθαν από τους Νομούς Σερρών και Δράμας εμφάνισαν υψηλότερες τιμές όσο αφορά στην ανάπτυξη του μυκηλίου, στη σποροποίηση και στη βλαστικότητα των κονιδίων στις χαμηλότερες από τις θερμοκρασίες που εκτέθηκαν (12°και 18°C), ενώ οι απομονώσεις από την περιοχή της Χρυσούπολης (Νομός Καβάλας) εμφάνισαν υψηλότερες τιμές των συγκεκριμένων παραμέτρων στην υψηλότερη θερμοκρασία έκθεσης (24°C). Ο προσδιορισμός των φυλών των απομονώσεων του φυτοπαθογόνου έδειξε την ύπαρξη των φυλών 2, 6 και 22 στον Ελλαδικό χώρο. Η φυλή 22 προσδιορίζεται για πρώτη φορά παγκοσμίως. Η αξιολόγηση 30 ελληνικών ποικιλιών φασολιού ως προς τις αλληλεπιδράσεις τους με το σύνολο των ελληνικών απομονώσεων του C. lindemuthianum, είχε σαν αποτέλεσμα τη διάκρισή τους σε εννέα διαφορετικές ομάδες. Μεταξύ αυτών, η ομάδα των ποικιλιών Ithomi FS60 και Larisa εμφάνισε ανθεκτικότητα σε τεχνητές μολύνσεις με όλες τις απομονώσεις του φυτοπαθογόνου παράγοντα. Παράλληλα χαρακτηρίσθηκαν οι απομονώσεις του μύκητα με βάση την παθογόνο ικανότητά τους στη συλλογή του ελληνικού φυτικού υλικού, από τον οποίο προέκυψαν επτά διαφορετικοί τύποι παθογόνου ικανότητας, καθένας από τους οποίους περιείχε μόνο απομονώσεις της αυτής γεωγραφικής προέλευσης. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης τυχαίων πολλαπλασιαζόμενων τμημάτων DNA (RAPDs), της ανάλυση πολυμορφισμού μήκους περιοριστικού θραύσματος (RFLP), της ανάλυση τυχαίων πολλαπλασιαζόμενων μικροδορυφόρων DNA (RAM) και της PCR βασιζόμενης σε επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες του γονιδιώματος (ERIC - BOX PCR) των ελληνικών απομονώσεων του C. lindemuthianum φανέρωσαν την παρουσία δύο ομάδων απομονώσεων. Η RAPDs ανάλυσης φανέρωσε την ύπαρξη δύο κύριων ομάδων απομονώσεων (πρώτη ομάδα απομονώσεων: BV1 έως BV17, BN1, BN3 έως BN8, BN10 έως BN12, BN14 έως BN16, BH1, BH2 και δεύτερη ομάδα απομονώσεων: BN2, BN9, BN13, UPS2, UPS36S), με το 91% των ελληνικών απομονώσεων να ανήκουν στην ίδια ομάδα. Η ομαδοποίηση από την RFLP ανάλυση εμφάνισε σχεδόν απόλυτη ταύτιση με την προηγούμενη τεχνική, κατατάσσοντας το 94% των συγκεκριμένων απομονώσεων στην ίδια ομάδα. Οι άλλες δύο τεχνικές που έχουν σαν στόχο τους το σύνολο του γονιδιώματος (RAM και ERIC - BOX PCR) παρουσίασαν, επίσης, ικανοποιητική έως υψηλή συσχέτιση με τα αποτελέσματα της RAPDs ανάλυσης (συσχέτιση RAM και RAPDs: r = 0,71, p = 0,05, συσχέτιση ERIC - BOX PCR και RAPDs: r = 0,49, p = 0,05, συσχέτιση RAMs και ERIC - BOX PCR: r = 0,58, p = 0,05), κατατάσσοντας είτε με ταυτόσημο (RAMs) ή με υψηλή ομοιότητα (ERIC - BOX PCR) τις απομονώσεις του μύκητα. Τα βακτηριακά στελέχη Pseudomonas fluorescens WCS 365 και P. chlororaphis PCL 1391 αξιολογήθηκαν όσο αφορά στην αντιμετώπιση των παθογόνων φυλών 2, 6 και 22 του Colletotrichum lindemuthianum, σε in vitro και in planta πειραματικό περιβάλλον. Οι in vitro δοκιμές βιολογικής αντιμετώπισης των παθογόνων φυλών του μύκητα έδειξαν ότι το βακτηριακό στέλεχος P. chlororaphis PCL1391, εφαρμοζόμενο είτε μεμονωμένα ή σε συνδυασμό με το P. fluorescens WCS365, μείωνε σημαντικά την ανάπτυξη και τη σποροποίηση των αποικιών του μύκητα, ενώ η εφαρμογή του σε διπλές και τριπλές καλλιέργειες με το φυτοπαθογόνου είχε σαν αποτέλεσμα την ελάττωση του ποσοστού βλαστικότητας των κονιδίων και των τριών φυλών του μύκητα. Η επίδραση του P. chlororaphis PCL 1391 αποδόθηκε στην παραγωγή του μεταβολίτη φεναζίνη - 1 - καρβοξυαμίδη (PCN), η ύπαρξη και η παραγωγή του οποίου επιβεβαιώθηκε από τα αποτελέσματα της χρωματογραφίας λεπτής στοιβάδας (TLC). Τα πειράματα αποικισμού φανέρωσαν την αυξημένη ικανότητα των συγκεκριμένων στελεχών να αποικίζουν το ριζικό σύστημα του φασολιού και ιδιαίτερα το ακραίο τμήμα του, ενώ, ο συνδυασμός τους φάνηκε ευεργετικός όσο αφορά την ικανότητα αποικισμού του P. chlororaphis PCL1391, σε αντίθεση με τη συμπεριφορά που επέδειξε το P. fluorescens WCS365, του οποίου ο πληθυσμός στο ριζικό σύστημα των φυτών εμφανιζόταν μειωμένος. Η εφαρμογή του P. chlororaphis PCL1391 και ιδιαίτερα του συνδυασμού του με το P. fluorescens WCS365, ανεξάρτητα από την παρουσία των φυτοπαθογόνων φυλών του μύκητα, είχε σαν αποτέλεσμα την εμφάνιση αυξημένων τιμών στο σύνολο των βιολογικών χαρακτηριστικών των φυτών. Το P. fluorescens WCS365, αν και αποικίζει σε ικανοποιητικό βαθμό το ριζικό σύστημα, δεν επηρέασε την ανάπτυξη των φυτών. Η συνδυασμένη εφαρμογή των βακτηριακών στελεχών συνέβαλε στη μειωμένη εκδήλωση των συμπτωμάτων της ασθένειας. Τα φυτά στα οποία πραγματοποιήθηκε μεμονωμένη εφαρμογή του P. chlororaphis PCL1391 εμφάνισαν, επίσης, θετικά αποτελέσματα όσο αφορά στην αντιμετώπιση της ασθένειας, σε βαθμό, όμως, μικρότερο σε σύγκριση με τη συνδυασμένη επέμβαση. Τα αποτελέσματα της εφαρμογής του P. fluorescens WCS365 δεν διαφοροποιήθηκαν από την επέμβαση του θετικού μάρτυρα.