Μελέτη παραγόντων που επιδρούν στην ανάπτυξη μυκήτων και στη βιοσύνθεση των καρκινογόνων μεταβολιτών τους

Abstract

Aflatoxins, produced as secondary fungal metabolites by some toxigenic strains of the Aspergillus species, are known as highly toxic and potent carcinogenic mycotoxins. Over the past years they have received the attention of the scientific community because of their disastrous effects on human and animal health as well as on agricultural commodities. It is well known that aflatoxin biosynthesis involves lipid peroxidation with the presence of fatty acid hydroperoxides promoting aflatoxin production. Methyl jasmonate (MeJA) is a plant growth regulator as well as the plants response to environmental stress and to wounding by insect and pathogen attack. It derives from α-linolenic acid, which is oxygenised by a LOX-enzyme to 13S-hydroperoxylinolenic acid. Fungal attack by certain Aspergillus species is likely to induce the synthesis of this secondary metabolite.This study reports of the effect of MeJA added at different concentrations on the growth of A.parasiticus and AFB1 in two rather different media, namely a nutrient medium of well defined composition (YES) as well as an edible plant of Greek origin, caper.MeJA was added to the YES cultures of A.parasiticus at the following concentrations: 1) 0,0022 mg MeJA/10mL YES (10-6Μ), 2) 0,227 mg MeJA/10mL YES (10-4Μ), 3) 1,134 mg MeJA/10mL YES (0,0005Μ), 4) 2,267 mg MeJA/10mL YES (10-3Μ), 5) 4,534 mg MeJA/10mL YES (0,002Μ), 6) 9,067 mg MeJA/10mL YES (0,004Μ), 7) 18,134 mg MeJA/10mL YES (0,008Μ), 8) 22,667 mg MeJA/10mL YES (10-2Μ), 9) 36,267 mg MeJA/10mL YES (0,016Μ) and 10) 226,67 mg MeJA/10mL YES (10-1Μ).At the same time, the biosynthesis of AFB1 in YES medium during an incubation time of 25 days was studied.AFB1 is determined from methanol extracted mycelia, followed by immunoaffinity clean-up and finally HPLC method after derivatization to AFB2a. The recovery percentage of the method is 99% and the detection limit 0,02 ng mL-1 YES.Following the process of the AFB1 biosynthesis in YES medium, resulted in the 18th day of incubation being the day of maximum AFB1 production. According to the results of the MeJA addition to the YES cultures, mycelial growth as well as AFB1 output depend on the MeJA concentration in the sample. In detail, adding MeJA in a quantity of 0,0022 mg MeJA/10mL YES (10-6Μ), stimulated fungal growth and AFB1 production concomitantly in a statistically significant way (p=0.05) at the 12th day of incubation. MeJA at a concentration of 10-4M in the YES cultures had no apparent effect on the mycelial growth but did increase AFB1 output significantly (p=0.05) at the 12th day of incubation. Furthermore, MeJA added to the YES medium in quantities of 1,134 mg MeJA/10mL YES (0,0005Μ), 2,267 mg MeJA/10mL YES (10-3Μ) and 4,534 mg MeJA/10mL YES (0,002Μ) decreased significantly (p=0.05) fungal growth during the entire incubation time while the AFB1 biosynthesis rate was decreased after the 15th day of observation in a statistically significant way (p=0.05). YES cultures with a MeJA concentration of 0,004Μ, 0,008Μ, 10-2Μ, 0,016Μ και 10-1Μ per flask exhibited an inhibitory effect of both A.parasiticus growth and AFB1 production during the entire incubation time in a statistically significant way (p=0.05).According to the above data, the minimum quantity of MeJA required for the complete inhibition of the AFB1 biosynthesis in YES medium containing 102 A.parasiticus conidia lies at 9,067 mg/10 mL YES.In order to study the AFB1 biosynthesis along with the effect of different concentrations of MeJA on the A.parasiticus fungal growth as well as the AFB1 production in caper, a method for determining AFB1 in caper was developed. The detection limit of the method is 0,06 ng g-1, the quantification limit is 0,12 ng g-1 while the recovery percentage lies at 79%. According to the data, the determination method shows accuracy, reliability and sensitivity.The AFB1 biosynthesis during an incubation time of 25 days was thereupon studied, similarly to the YES samples. At the same time, MeJA at 5 different concentrations in the caper samples was studied in terms of its effect on the AFB1 biosynthetic course for an incubation time of 15 days. The following MeJA quantities were added to the samples: 1) 0,0022 mg MeJA/15g caper (10-6Μ), 2) 0,227 mg MeJA/15g caper (10-4Μ), 3) 2,267 mg MeJA/15g caper (10-3Μ), 22,667 mg MeJA/15g caper (10-2Μ ) and 4) 226,67 mg MeJA/15g caper (10-1Μ).The highest level of AFB1 output occurred at the 12th day of incubation followed, in contrast to YES cultures, by a decreased rate of the biosynthesis.According to the results obtained from the AFB1 determination in the MeJA containing caper samples, fungal processes of A.parasiticus are greatly affected by MeJA in a dose-dependent manner in this case as well. MeJA at a concentration of 10-6M in caper significantly (p=0.05) stimulated AFB1 production after the 9th day of incubation. MeJA at concentrations of 10-4M and 10-3M in caper significantly (p=0.05) decreased AFB1 output during the entire incubation time. The calculated ic50 for MeJA was 0,433 mg g-1. Finally, MeJA added to the caper samples at the highest concentration - 22,667 mg MeJA/15g caper (10-2Μ ) and 226,67 mg MeJA/15g caper (10-1Μ) - inhibited AFB1 in a statistically significant way (p=0.05) during the entire incubation time. AFB1 was inhibited by 97,74% and 98,42% on the 12th of observation by MeJA at concentrations 10-2M and 10-1M respectively.Following the results of this study, it is evident that both A.parasiticus fungal growth as well as AFB1 biosynthesis depend on the concentration of MeJA. Moreover, MeJA at low concentrations (10-6M) induced a stimulation of the AFB1 production.The fact that high concentrations of the plant regulator significantly inhibited the mycotoxin output regardless of the used medium or substrate is of great importance and offers an interesting perspective in the field of the prevention of aflatoxin contamination of stored crops and foodstuffs.The mode of action of MeJA is still unclear. In order to answer some of the questions, which arose from its effects on the aflatoxigenic fungus A.parasiticus, an approach at a genetic level was attempted, which is in progress.

Οι Αφλατοξίνες είναι ισχυρά τοξικές και καρκινογόνες ουσίες και αποτελούν προϊόντα δευτερογενούς μεταβολισμού ορισμένων μυκήτων του γένους Aspergillus, οι οποίοι προσβάλλουν φυσικά προϊόντα και κυρίως ελαιώδεις καρπούς. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η Αφλατοξίνη Β1 (ΑΦΒ1), η οποία χαρακτηρίζεται ως η πιο επικίνδυνη φυσικώς παραγόμενη χημική ένωση.Η βιοσύνθεση της ΑΦΒ1 από τους μύκητες A.flavus και A.parasiticus επηρεάζεται, μεταξύ των άλλων, από τα λιποϋπεροξείδια των ακόρεστων λιπαρών οξέων, καθώς και από το μεθυλιασμονικό οξύ (MeJA), το οποίο σχηματίζεται από την υδροϋπεροξείδωση του α-λινολενικού οξέος μέσω της λιποξυγενάσης και αποτελεί βασικό ρυθμιστή ανάπτυξης των φυτών αλλά ταυτόχρονα και ένωση απόκρισής τους σε εξωτερικές πιέσεις (stress) βιοτικού και αβιοτικού χαρακτήρα. Καθώς οι αφλατοξινογόνοι μύκητες προσβάλλουν τα φυτά, η έκθεσή τους στο MeJA είναι πολύ πιθανή.Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η επίδραση διαφορετικών συγκεντρώσεων MeJA στη μυκηλιακή ανάπτυξη του A.parasiticus και στη βιοσύνθεση της ΑΦΒ1 σε δύο πολύ διαφορετικά υποστρώματα. Ένα θρεπτικό υλικό συγκεκριμένης σύστασης, το εκχύλισμα ζύμης σακχαρόζης (YES) και ένα φυτικό βρώσιμο προϊόν ελληνικής προέλευσης, την κάππαρη.Στο θρεπτικό υλικό YES μελετήθηκαν παράλληλα η βιοσυνθετική πορεία της ΑΦΒ1 για συνολικό διάστημα 25 ημερών επώασης και η επίδραση της προσθήκης των εξής ποσοτήτων MeJA στην πορεία αυτή: 1) 0,0022 mg MeJA/10mL YES, 2) 0,227 mg MeJA/10mL YES, 3) 1,134 mg MeJA/10mL YES, 4) 2,267 mg MeJA/10mL YES, 5) 4,534 mg MeJA/10mL YES, 6) 9,067 mg MeJA/10mL YES, 7) 18,134 mg MeJA/10mL YES, 8) 22,667 mg MeJA/10mL YES, 9) 36,267 mg MeJA/10mL YES και 10) 226,67 mg MeJA/10mL YES. Οι ποσότητες αυτές αντιστοιχούν σε συγκεντρώσεις 10-6Μ, 10-4Μ, 0,0005Μ, 10-3Μ, 0,002Μ, 0,004Μ, 0,008Μ, 10-2Μ, 0,016Μ και 10-1Μ MeJA ανά 10 mL YES.Ο προσδιορισμός της ΑΦΒ1 περιλαμβάνει το στάδιο εκχύλισής από τα μυκήλια στο YES με MeOH, τον καθαρισμό της με μικροστήλες ανοσοσυγγένειας και τέλος τον ποσοτικό προσδιορισμό της με HPLC και ανιχνευτή φθορισμού, αφού προηγηθεί παραγωγοποίηση της ΑΦΒ1 προς το αντίστοιχο φθορίζον παράγωγό της, την ΑΦΒ2α. Η μέθοδος έχει ποσοστό ανάκτησης 99% και όριο ανίχνευσης 0,02 ng mL-1 YES.Από την παρατήρηση της πορείας βιοσύνθεσης της ΑΦΒ1 από τον A.parasiticus στο YES για συνολικό διάστημα 25 ημερών προέκυψε ότι η μέγιστη παραγωγή ΑΦΒ1 εντοπίζεται τη 18η ημέρα επώασης.Τα αποτελέσματα των πειραμάτων με το MeJA έδειξαν πως η παρουσία του επηρεάζει τη μυκηλιακή ανάπτυξη και την παραγωγή της ΑΦΒ1 προκαλώντας αναστολή η διέγερση ανάλογα με τη συγκέντρωση που επιδρά στο σύστημα του μύκητα. Πιο συγκεκριμένα, η προσθήκη της μικρότερης ποσότητας MeJA (0,0022 mg/κωνική, 10-6Μ) προκάλεσε στατιστικά σημαντική (p=0.05) αύξηση της παραγωγής της μυκηλιακής μάζας και διέγερση της παραγωγής της ΑΦΒ1, η οποία θεωρείται στατιστικά σημαντική (p=0.05) κατά τη 12η ημέρα επώασης. Η προσθήκη της αμέσως μεγαλύτερης ποσότητας MeJA από όσες συνολικά μελετήθηκαν (0,227 mg/κωνική, 10-4Μ) αύξησε το ρυθμό βιοσύνθεσης της ΑΦΒ1 σε στατιστικά σημαντικό επίπεδο (p=0.05) μόνο κατά τη 12η ημέρα επώασης χωρίς να επηρεάζει σημαντικά τη μυκηλιακή ανάπτυξη. Η παρουσία MeJA στις συγκεντρώσεις 0,0005Μ, 10-3Μ και 0,002Μ ανά κωνική είχε σαν αποτέλεσμα τη στατιστικά σημαντική (p=0.05) μείωση της παραγωγής της μυκηλιακής μάζας σε όλο το διάστημα παρατήρησης και τη μείωση του ρυθμού βιοσύνθεσης της ΑΦΒ1, σε στατιστικά σημαντικό βαθμό μετά τη 15η ημέρα επώασης. Από τα αποτελέσματα της έρευνας στα δείγματα με συγκεντρώσεις MeJA 0,004Μ, 0,008Μ, 10-2Μ, 0,016Μ και 10-1Μ ανά κωνική προέκυψε ότι σε όλες τις περιπτώσεις υπήρχε αναστολή της μυκηλιακής ανάπτυξης και της παραγωγής της ΑΦΒ1, η οποία ήταν στατιστικά σημαντική (p=0.05) σε όλο το διάστημα παρατήρησης.Σύμφωνα με τα παραπάνω δεδομένα η ελάχιστη ποσότητα MeJA που απαιτείται για την πλήρη αναστολή της βιοσύνθεσης της ΑΦΒ1 σε θρεπτικό υλικό YES εμβολιασμένο με 102 κονίδια του μύκητα A.parasiticus είναι 9,067 mg/10 mL YES.Για την παρατήρηση της βιοσύνθεσης της ΑΦΒ1 και τη μελέτη στη συνέχεια της επίδρασης διαφορετικών συγκεντρώσεων του MeJA στην ανάπτυξη του A.parasiticus και στην παραγωγή της ΑΦΒ1 στην κάππαρη, αναπτύχθηκε και επικυρώθηκε μία μέθοδος προσδιορισμού της ΑΦΒ1 στο συγκεκριμένο υπόστρωμα. Ο προσδιορισμός της ΑΦΒ1 περιλαμβάνει την εκχύλισή της από τη συνολική μάζα του μύκητα που αναπτύχθηκε στην κάππαρη μαζί με το φυτό με μίγμα MeOH:H2O (80:20 v/v), τον καθαρισμό της με μικροστήλες ανοσοσυγγένειας, τη μετατροπή της προς την ημιακετάλη ΑΦΒ2α και τον ποσοτικό προσδιορισμό της με HPLC που διαθέτει ανιχνευτή φθορισμού. Το όριο ανίχνευσης της μεθόδου βρέθηκε ότι είναι 0,06 ng g-1 κάππαρης, το όριο ποσοτικοποίησης 0,12 ng g-1 κάππαρης και το ποσοστό ανάκτησης 79%. Από τα αποτελέσματα και τη στατιστική επεξεργασία, η μέθοδος κρίθηκε ακριβής, αξιόπιστη και ευαίσθητη.Αντίστοιχα με την περίπτωση του θρεπτικού υλικού YES, μελετήθηκαν στην κάππαρη η πορεία βιοσύνθεσης της ΑΦΒ1 για συνολικό διάστημα 25 ημερών και παράλληλα η επίδραση της παρουσίας διαφορετικών συγκεντρώσεων MeJA στην εξέλιξη της βιοσυνθετικής πορείας της ΑΦΒ1 για 15 ημέρες. Οι ποσότητες MeJA που προ-στέθηκαν είναι οι εξής: 1) 0,0022 mg MeJA/15g κάππαρης, 2) 0,227 mg MeJA/15g κάππαρης, 3) 2,267 mg MeJA/15g κάππαρης, 4) 22,667 mg MeJA/15g κάππαρης και 5) 226,67 mg MeJA/15g κάππαρης. Οι ποσότητες αυτές αντιστοιχούν σε συγκεντρώσεις 10-6Μ, 10-4Μ, 10-3Μ, 10-2Μ και 10-1Μ MeJA ανά 15g κάππαρης.Η μέγιστη παραγωγή ΑΦΒ1 στην κάππαρη εμφανίζεται τη 12η ημέρα παρατήρησης και στη συνέχεια, σε αντίθεση με το θρεπτικό υλικό YES, ο ρυθμός βιοσύνθεσης αρχίζει να μειώνεται.Ο προσδιορισμός της παραγόμενης ΑΦΒ1 στα δείγματα που περιείχαν MeJA διαφορετικών συγκεντρώσεων έδειξε πως και στην περίπτωση ενός σύνθετου και τόσο διαφορετικού υποστρώματος - σε σχέση με το YES - όπως είναι η κάππαρη, η προσθήκη MeJA επηρεάζει τις διεργασίες του μύκητα και η επιρροή αυτή εξαρτάται σε σημαντικό βαθμό από τη συγκέντρωση του φυτικού ρυθμιστή. Αναλυτικότερα, η προσθήκη MeJA στη μικρότερη ποσότητα (10-6Μ) προκάλεσε στατιστικά σημαντική (p=0.05) διέγερση στην παραγωγή της ΑΦΒ1 στο χρονικό διάστημα από την 9η έως και την 15η ημέρα. Η παρουσία του MeJA σε συγκέντρωση 10-4Μ στο δείγμα προκάλεσε αναστολή στο φαινόμενο της βιοσύνθεσης της ΑΦΒ1, η οποία ήταν στατιστικά σημαντική (p=0.05) στο σύνολο των ημερών επώασης. Αντίστοιχη ήταν και η επίδραση της προσθήκης 2,267 mg MeJA (10-3Μ/κωνική). Μεταξύ των δύο αυτών συγκεντρώσεων υπολογίσθηκε ότι βρίσκεται η μέση ανασταλτική συγκέντρωση ic50 για το MeJA (0,433 mg . κωνική-1). Τέλος, η παρουσία του MeJA στις πιο μεγάλες συγκεντρώσεις (10-2Μ και 10-1Μ) ανέστειλε την παραγωγή της ΑΦΒ1 σε στατιστικά σημαντικά (p=0.05) επίπεδα στο σύνολο των ημερών επώασης φτάνοντας τη 12η ημέρα παρατήρησης το ποσοστό αναστολής 97,74% και 98,42% για τις δύο περιπτώσεις αντίστοιχα.Από τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας προέκυψε ότι η επίδραση του MeJA στην ανάπτυξη του μύκητα A.parasiticus και στη βιοσύνθεση της ΑΦΒ1 εξαρτάται σημαντικά από τη συγκέντρωσή του και ταυτόχρονα ότι ανεξάρτητα από το υπόστρωμα που χρησιμοποιήθηκε για τις συγκεκριμένες μελέτες, η παρουσία του MeJA σε χαμηλή συγκέντρωση (10-6Μ) είχε σαν συνέπεια τη διέγερση της βιοσύνθεσης της ΑΦΒ1.Σημαντικό είναι το γεγονός ότι οι υψηλότερες συγκεντρώσεις MeJA ανέστειλαν δραματικά την παραγωγή της τοξίνης, γεγονός που ανοίγει ενδιαφέρουσες προοπτικές για τη χρήση της αναστολής από το μεθυλιασμονικό οξύ στον τομέα της πρόληψης της επιμόλυνσης των αποθηκευμένων τροφίμων από αφλατοξινογόνους μύκητες, όπως είναι ο A.parasiticus.Ο τρόπος δράσης του MeJA δεν έχει ακόμη διευκρινιστεί. Προκειμένου να δοθούν κάποιες απαντήσεις σε ερωτήματα σχετικά με την επίδρασή του στον αφλατοξινογόνο μύκητα A.parasiticus, επιχειρήθηκε μία προσέγγιση αυτής της σχέσης σε γονιδιακό επίπεδο, η οποία είναι σε εξέλιξη. Για το σκοπό αυτό απομονώθηκε RNA από καλλιέργειες του μύκητα με και χωρίς προσθήκη MeJA και έγινε μία προσπάθεια μελέτης της έκφρασης δύο γονιδίων - των aflC και aflR - που θεωρούνται καθοριστικά για τη βιοσύνθεση της ΑΦΒ1.