Κυτταρική σύνθεση του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος σε παιδιά με αναπνευστικά προβλήματα

Abstract

Bronchoalveolar lavage is one the most interesting potentials that bronchoscopy offers. It is unethical to bronchoscope a child in order to perform bronchoalveolar lavage for purely research purposes. Therefore, there are very few papers on bronchoalveolar lavage in “normal” children, none of which comes from Greece. Also, there is no paper that simultaneously studied the cellular synthesis of bronchoalveolar lavage in non inflammatory and inflammatory lung diseases grouped, in order to enable their distinction and also the comparison of the findings with those of studies in adults. For the aforementioned reasons the aim of our study was to investigate: • The cellular synthesis of bronchoalveolar lavage in children with lung diseases, inflammatory and non inflammatory. • The presence of inflammatory mediators in the bronchoalveolar lavage in children with lung diseases, inflammatory and non inflammatory. • The correlation of the findings with the findings in studies of adults. Our greater aim was to establish the cellular and acellular synthesis (cytokines and chemokines) of bronchoalveolar lavage in children with an indication for bronchoscopy, helping to build a database for future studies on inflammatory and non inflammatory lung diseases, since the available literature is limited. 74 children (22 female) were initially studied, aged 2.5 months to 16 years old, which had an indication for a diagnostic or therapeutic bronchoscopy. 22 children were excluded from the study, because their lavage samples were not acceptable. A sample was considered to be technically unacceptable for analysis when there were more than 5% of epithelial cells, or fluid recovery was less than 40%, or staining was poor or when there was excessive mucous -despite filtration through a gauge- that rendered microscopy impossible. Therefore, the final material of the study consisted of 52 children, whose lavage samples were acceptable for analysis. The cellular synthesis of the bronchoalveolar lavage was studied both conventionally and with flow cytometry. Specifically, cellular analysis was performed with optical microscopy following cytocenrifugation and staining with May-Gruwald-Giemsa; lymphocyte subsets were determined with flow cytometry using appropriate monoclonal antibodies. Additionally, the following cytokines were measures by ELISA: Interleukin 4 (IL-4), interleukin 5 (IL-5), interleukin 8 (IL-8), interleukin 18 (IL-18), eotaxin and Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α). Two groups of children were formed based on the clinical diagnosis and the bronchoscopic findings. Group A (control group) consisted of 20 children that were afebrile, had no leukocytosis on full blood count, their diagnosis was not indicative of tracheobronchial inflammation and bronchoscopy was normal. Group B consisted of 32 children with a clinical diagnosis suggestive of tracheobronchial inflammation and bronchoscopic evidence of inflammation. 8 children with cystic fibrosis were also analysed as a subgroup of group B (subgroup CF), in order to look for characteristic findings, due to the chronic inflammation of the tracheobronchial tree. Groups A and B and subgroup CF were similar in terms of sex distribution, age, weight, personal and family history of atopy and IgE levels in blood. No serious complications occurred during or after bronchoscopy. 13.5% of children had episodes of oxyhaemoglobin desaturation. 7% of children developed fever within 24 h following bronchoscopy; pyrexia subsided following administration of paracetamol and tepid sponging. Mucosal redness and presence of abundant secretions were the commonest bronchoscopic findings in Group B children. Bronchoscopy of Group A children revealed no signs of endobronchial inflammation. Mean and median values of fluid recovery in children of Group A were 61.21% and 62.80% respectively. These findings are similar to the ones reported in the few studies in the literature. Fluid recovery in Group B children was significantly lower (median value 53.85, p=0.043). Median value of cellular density (CD) in Bronchoalveolar lavage in Group A was 15.10⁴ cells/ml. The predominant cells were alveolar macrophages (mean±SD=93.33±4.56%), similar to what has been reported for adults. Lymphocytes (mean±SD=3.93±3.08%) and neutrophils (mean±SD=2.94±2.82%) were found less frequently. In children of Group B (children with inflammatory lung diseases) CD was significantly higher (median value 28.95.10⁴ cells/ml, p=0.008). Also, the percentage of neutrophils (mean±SD=49.59±26.72%) was significantly higher compared to the control group (p<0.001), while the percentage of alveolar macrophages (mean±SD=42.59±23.32%) was significantly lower (p<0.001). There was no statistically significant difference between the 2 groups in the percentage of lymphocytes in the bronchoalveolar lavage. Also, we found no statistically significant difference between the 2 groups in lymphocyte subpopulations measured by flow cytometry (B, T, NK cells and lymphocyte subsets). The ratio of helper to cytotoxic T cells (CD4+/CD8+) in the control group was higher than previously reported in two paediatric papers. This finding is similar to what has been reported regarding this ratio in studies of bronchoalveolar lavage in adults and in studies of the peripheral blood in children. The measurement of inflammatory mediators and of cytokines that promote type 2 immune response (atopy) revealed the following: IL-8 and TNF-α levels were significantly higher in Group B compared to Group A (p=0.017 and 0.012 respectively). Eotaxin was detected only in children of Group B with bronchoalveolar lavage eosinophilia (range 28.8 to 36.8pg/ml), while it was undetectable in all children of Group A. There was no statistically significant difference between the 2 groups regarding levels of IL-18 (p=0.447), IL-4 (p=0.061) and IL-5 (p=0.913). All the aforementioned parameters were also analysed for subgroup CF (children with Cystic fibrosis) compared to Group A. Findings were similar to those of the entire Group B. In conclusion, bronchoscopy and bronchoalveolar lavage are safe when performed according to published guidelines. No tragic complications were encountered during our study. Results regarding the cellular synthesis of bronchoalveolar lavage of children with non inflammatory lung diseases (group A) were comparable to the results of studies in adult healthy volunteers and those of “normal” children in the few studies available. Neutrophilia characterised the bronchoalveolar lavage of children with inflammatory lung diseases. In these children IL-8 and TNF-α levels were significantly raised. Τhere was no difference between the 2 groups regarding IL-18 levels. Also, there was no difference regarding IL-4 and IL-5; this was expected, since there was no difference between the 2 groups regarding atopic predisposition. Eotaxin was detected only in 2 patients with eosinophilia. There was no difference in terms of lymphocyte subsets or helper to cytotoxic T lymphocytes ratio (CD4+/CD8+) between the two groups. These are the first data on bronchoalveolar lavage cellular synthesis and lymphocyte subsets in Greek children with inflammatory and non inflammatory lung conditions and they may serve as a database for future research bronchoscopic studies.

Μία από τις πιο σημαντικές δυνατότητες που παρέχει η ενδοσκόπηση του αναπνευστικού συστήματος είναι η λήψη βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος. Στα παιδιά, η βρογχοσκόπηση και η λήψη βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος δεν επιτρέπεται να γίνουν μόνο για ερευνητικούς σκοπούς. Έτσι, υπάρχουν ελάχιστες μελέτες «φυσιολογικών» παιδιών στη διεθνή βιβλιογραφία, ενώ δεν έχει γίνει τέτοια μελέτη στον Ελληνικό χώρο. Σε καμμιά μελέτη δεν ερευνήθηκε συγχρόνως η κυτταρική σύνθεση του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος σε φλεγμονώδεις και μη φλεγμονώδεις πνευμονοπάθειες ομαδοποιημένα, ώστε να γίνει διαχωρισμός των ευρημάτων μεταξύ των δύο αυτών διαφορετικών καταστάσεων του αναπνευστικού συστήματος στα παιδιά και να αξιολογηθούν τα ευρήματα σε σχέση με τα βιβλιογραφικά δεδομένα στους ενήλικες. Για τους λόγους αυτούς η παρούσα μελέτη είχε σκοπό να ερευνήσει: 1. Τη σύνθεση του κυτταρικού πληθυσμού και των μεσολαβητικών ουσιών της φλεγμονής που ανευρίσκονται στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα των παιδιών με διάφορα αναπνευστικά προβλήματα, φλεγμονώδη και μη φλεγμονώδη. 2. Τη συσχέτιση των ευρημάτων με τα αντίστοιχα στους ενήλικες. Απώτερος στόχος της μελέτης ήταν να θεμελιωθεί μια «βάση δεδομένων» για τα φλεγμονώδη και μη φλεγμονώδη αναπνευστικά προβλήματα των παιδιών ώστε να είναι πιο αξιόπιστη η αξιολόγηση των ευρημάτων του BAL στα παιδιά, διότι η υπάρχουσα βιβλιογραφία είναι πολύ περιορισμένη. Μελετήθηκαν αρχικά εβδομήντα τέσσερα παιδιά (22 κορίτσια και 52 αγόρια) ηλικίας 2,5 μηνών έως 15 ετών και 10 μηνών τα οποία είχαν ένδειξη βρογχοσκόπησης για διαγνωστικούς ή και θεραπευτικούς σκοπούς. Είκοσι δύο από τα παιδιά αυτά αποκλείσθηκαν από τη μελέτη λόγω ακαταλληλότητας των δειγμάτων. Ως ακατάλληλα, θεωρήθηκαν δείγματα με αυξημένο αριθμό επιθηλιακών κυττάρων, μικρό ποσοστό επιστρεφόμενου όγκου σε σχέση με τον αρχικά χορηγηθέντα (μικρότερο του 40%), κακή χρώση των κυττάρων ή παρουσία άφθονης βλέννης (παρά την επεξεργασία διήθησης με γάζα) που καθιστούσε αδύνατη την παρατήρηση των διαφόρων κυττάρων με το οπτικό μικροσκόπιο. Έτσι, το τελικό υλικό που αξιολογήθηκε περιλάμβανε δείγματα από πενήντα δύο παιδιά, τα οποία δείγματα ήταν κατάλληλα για τους σκοπούς της μελέτης. Η κυτταρική σύνθεση του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος (BAL) μελετήθηκε τόσο με τη συμβατική μέθοδο όσο και με κυτταρομετρία ροής. Ειδικότερα, ελέγχθηκε ο κυτταρικός φαινότυπος του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος στο κοινό μικροσκόπιο μετά από φυγοκέντρηση και χρώση May-Gruwald-Giemsa καθώς και ο ανοσοφαινότυπος (λεμφοκυτταρικοί υποπληθυσμοί) με κυτταρομετρία ροής με τη χρήση των κατάλληλων μονοκλωνικών αντισωμάτων. Επιπλέον προσδιορίστηκαν με ELISA τα επίπεδα των κυτταροκινών που σχετίζονται με χρόνια φλεγμονή ατοπικής και μη αιτιολογίας: ιντερλευκίνη 4 (IL-4), ιντερλευκίνη 5 (IL-5), ιντερλευκίνη 8 (IL-8), ιντερλευκίνη 18 (IL-18), εοταξίνη και παράγοντας νέκρωσης όγκων (TNF). Τα παιδιά αυτά χωρίστηκαν σε δύο ομάδες με βάση την κλινική διάγνωση και τα βρογχοσκοπικά τους ευρήματα. Η πρώτη ομάδα (ομάδα Α ή ομάδα ελέγχου) περιλάμβανε παιδιά απύρετα, χωρίς λευκοκυττάρωση στον τύπο του περιφερικού αίματος και διάγνωση που δεν προδίκαζε φλεγμονή του τραχειοβρογχικού δένδρου, γεγονός που επιβεβαιώθηκε κατά τη βρογχοσκόπηση. Στην πρώτη αυτή ομάδα εντάχθηκαν 20 παιδιά. Η δεύτερη ομάδα (ομάδα Β) περιλάμβανε παιδιά των οποίων η κλινική και εργαστηριακή εικόνα ήταν συμβατή με φλεγμονή του τραχειοβρογχικού δένδρου, γεγονός που επιβεβαιώθηκε κατά τη βρογχοσκόπηση. Η ομάδα Β περιέλαβε 32 παιδιά. Οκτώ παιδιά με Κυστική Ίνωση μελετήθηκαν και ξεχωριστά ως υποομάδα της ομάδας αυτής (Ομάδα ΚΙ), για την εντόπιση πιθανών χαρακτηριστικών ευρημάτων λόγω της χρόνιας φλεγμονής του τραχειοβρογχικού δένδρου. Οι ομάδες Α και Β καθώς και η υποομάδα ΚΙ δεν παρουσίαζαν στατιστικά σημαντικές διαφορές ως προς το φύλο, την ηλικία, το βάρος το ατομικό και οικογενειακό ιστορικό ατοπίας καθώς και τα επίπεδα της ανοσοσφαιρίνης Ε. Δεν παρατηρήθηκαν σοβαρές επιπλοκές κατά ή μετά τη βρογχοσκόπηση. Μικρό ποσοστό εμφάνισε επεισόδια πτώσης του κορεσμού της αιμοσφαιρίνης σε οξυγόνο (13,5%). Σε 7% των παιδιών παρατηρήθηκε πυρετός κατά το πρώτο εικοσιτετράωρο μετά τη βρογχοσκόπηση, που υφέθηκε με τη χορήγηση παρακεταμόλης και χρήση φυσικών μέσων (λουτρό και ψυχρά επιθέματα). Στα παιδιά της ομάδας Β κοινό χαρακτηριστικό της βρογχοσκοπικής εικόνας ήταν η ερυθρότητα του βλεννογόνου και η παρουσία άφθονων εκκρίσεων. Αντίθετα στα παιδιά της ομάδας ελέγχου δεν υπήρχαν ευρήματα ενδεικτικά φλεγμονής κατά τη βρογχοσκόπηση. Η μέση και η διάμεση τιμή του ποσοστού του επιστρεφόμενου όγκου σε σχέση με τον αρχικά χορηγηθέντα στα παιδιά της ομάδας ελέγχου ήταν αντίστοιχα 61,21% και 62,80%. Τα ποσοστά αυτά συμβαδίζουν με τα αναφερόμενα στις ελάχιστες μελέτες από τη διεθνή βιβλιογραφία. Το ποσοστό της επιστροφής στα παιδιά της ομάδας Β ήταν σημαντικά μικρότερο από το ποσοστό επιστροφής στα παιδιά της ομάδας ελέγχου (Διάμεση τιμή 53,65% έναντι 62,80%. p=0,043). Η διάμεση τιμή της κυτταρικής πυκνότητας στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα των παιδιών της ομάδας ελέγχου (ομάδα Α) ήταν 15x10⁴ κύτταρα/ml. Στην ομάδα ελέγχου ο κύριος κυτταρικός πληθυσμός ήταν τα κυψελιδικά μακροφάγα (Μ.Ο.±SD=93,33±4,56%), όπως και στους ενήλικες. Σε μικρότερα ποσοστά βρέθηκαν λεμφοκύτταρα (Μ.Ο.±SD=3,93±3,08%) και ουδετερόφιλα (Μ.Ο.±SD=2,94±2,82%). Αντίθετα, στα παιδιά της ομάδας Β (παιδιά με φλεγμονώδη νοσήματα του αναπνευστικού συστήματος) η κυτταρική πυκνότητα ήταν σημαντικά αυξημένη (διάμεση τιμή 28,95x10⁴ κύτταρα/ml έναντι 15x10⁴ κύτταρα/ml. p=0,008 αντίστοιχα). Επίσης, το ποσοστό των ουδετεροφίλων πολυμορφοπυρήνων (Μ.Ο.±SD=49,59±26,72) ήταν σημαντικά αυξημένο (p<0,001) σε σύγκριση με τα παιδιά της ομάδας ελέγχου (Μ.Ο.±SD=2,94±2,82%), ενώ το ποσοστό των μακροφάγων (Μ.Ο.± SD=42,59±23,32%) ήταν σημαντικά ελαττωμένο (Μ.Ο.± SD=93,33±4,56%, p<0,001). Τέλος, το ποσοστό των λεμφοκυττάρων στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα δεν διέφερε σημαντικά μεταξύ των 2 ομάδων (p=0,186). Επίσης, βρέθηκε ότι δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ των δύο ομάδων στους υποπληθυσμούς των λεμφοκυττάρων που μετρήθηκαν με κυτταρομετρία ροής(Β , Τ, ΝΚ κύτταρα και υποπληθυσμοί των Τ κυττάρων). Ο λόγος βοηθητικών προς κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα (CD4+/CD8+) στην ομάδα ελέγχου, βρέθηκε υψηλότερος από ότι σε δύο προηγούμενες δημοσιεύσεις σε παιδιά, εύρημα που ήταν συγκρίσιμο με αντίστοιχα στους ενήλικες και στο περιφερικό αίμα φυσιολογικών παιδιών. Η μελέτη ορισμένων ουσιών-μεσολαβητών της φλεγμονής καθώς και ορισμένων κυτταροκινών που επάγουν την τύπου 2 Τ κυτταρική (ανοσιακή) απάντηση (ατοπία), έδειξε τα εξής: Τα επίπεδα της IL-8 και τα επίπεδα του παράγοντα νέκρωσης των όγκων (Tumor necrosis Factor-α, TNF-α) βρέθηκαν σημαντικά αυξημένα στην ομάδα Β σε σχέση με την ομάδα ελέγχου(p=0,017 και p=0,012 αντίστοιχα). Η εοταξίνη ανιχνεύθηκε μόνο σε παιδιά της ομάδας Β με εωσινόφιλα στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα (εύρος τιμών 28,8 έως 36,8 pg/ml), ενώ δεν ανιχνεύθηκε σε κανένα παιδί της ομάδας ελέγχου. Δεν βρέθηκε διαφορά στα επίπεδα της IL-18 (p=0,447, της IL-4 (p=0,061) και IL-5 (p=0,913) στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα των παιδιών των δύο ομάδων. Έγινε σύγκριση των ευρημάτων όλων των προαναφερθέντων παραμέτρων(κυτταρική πυκνότητα, μακροφάγων, λεμφοκυττάρων,ουδετεροφίλων, Β και Τ λεμφοκυττάρων και υποπληθυσμών τους καθώς και κυτταροκινών και χημειοκινών) μεταξύ της ομάδας ελέγχου (Α) και της υποομάδας των παιδιών με Κυστική ίνωση. Τα ευρήματα ήταν τα ίδια όπως και για το σύνολο των παιδιών της ομάδας Β. Συμπερασματικά, η βρογχοσκόπηση και η βρογχοκυψελιδική έκπλυση είναι ασφαλείς στα παιδιά, όταν διενεργούνται με βάση τις διεθνείς κατευθυντήριες οδηγίες. Στην παρούσα μελέτη που ακολουθήθηκαν οι οδηγίες αυτές δεν υπήρξαν σοβαρά ανεπιθύμητα συμβάματα σε κανένα παιδί. Η κυτταρική σύνθεση του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος στα παιδιά με «μη φλεγμονώδη προβλήματα του αναπνευστικού συστήματος», όπως η ομάδα Α (ομάδα ελέγχου) της μελέτης μας ήταν συγκρίσιμη με τα ευρήματα φυσιολογικών ενηλίκων και παιδιών που θεωρήθηκαν ως «φυσιολογικά» στις ελάχιστες άλλες μελέτες που υπάρχουν στη διεθνή βιβλιογραφία. Η κυτταρική σύνθεση διέφερε όταν υπήρχε φλεγμονή στο κατώτερο αναπνευστικό σύστημα οπότε επικρατούσαν τα ουδετερόφιλα αντί των μακροφάγων και τα επίπεδα της κυτταροκίνης TNF-α και της χημειοκίνης IL-8 που προάγουν τη φλεγμονή ήταν αυξημένα. Αντίθετα, δεν υπήρχαν διαφορές μεταξύ των δύο ομάδων όσον αφορά τα επίπεδα των κυτταροκινών IL-4, IL-5 που προάγουν την ανοσιακή απάντηση τύπου 2 (Th2) και της IL-18, προφανώς επειδή δεν διέφεραν οι δύο ομάδες στη σύνθεσή τους ως προς τα παιδιά με ατοπικές καταστάσεις. Αυξημένα επίπεδα εοταξίνης βρέθηκαν μόνο σε ασθενείς με αυξημένα εοσινόφιλα. Τέλος, δεν υπήρχαν διαφορές μεταξύ των παιδιών με φλεγμονώδεις και μη φλεγμονώδεις καταστάσεις του αναπνευστικού, όσον αφορά τους υποπληθυσμούς των λεμφοκυττάρων και τον λόγο των βοηθητικών προς τα κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα (CD4+/CD8+). Τα ευρήματα αυτά αποτελούν τα πρώτα δεδομένα στο θέμα της κυτταρικής σύνθεσης του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος και τους υποπληθυσμούς των λεμφοκυττάρων σε φλεγμονώδεις και μη φλεγμονώδεις συνήθεις παθήσεις του αναπνευστικού συστήματος σε παιδιά στον Ελληνικό χώρο και μπορεί να χρησιμοποιηθούν ως θεμέλιος λίθος μίας «βάσης δεδομένων» για χρήση σε μελλοντικές ερευνητικές μελέτες παιδιών που έχουν ένδειξη βρογχοσκόπησης.