Συγκριτικός προσδιορισμός του ασκορβικού και δεϋδροασκορβικού οξέος στο πλάσμα και τα λευκά αιμοσφαίρια με τη μέθοδο της υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης

Abstract

The purpose of the present study is to find out the optimal conditions for the determination of AA with HPLC, so that stability, specificity and sensitivity to be achieved in the analysis of biological samples of human plasma and white cells. For this reason we investigated the most suitable conditions of sample treatment that ensures the quantitative reduction of DHA. Finally, in order to evaluate the reliability and precision of the assay, it is applied in a large number of samples obtained from healthy individuals, smokers and not smokers, i.e. in samples containing different concentration of AA. The method was applied to 100 healthy individuals men and women, smokers and non smokers. The individuals were separated in teams of 10, according to age (10 years) and sex and there was determination of AA and DHA in their plasma and white cells. Concisely, the following conclusions were derived from our research: 1) both phosphate buffer of pH=5 as well as metaphosphoric acid solution offers optimum stabilization of AA 2) the ideal method of determination is HPLC in combination with chromatographic column of reverse phase C18 and two detectors, ultraviolet and electrochemical in series 3) the optimal conditions of reduction of DHA in AA is pH=7 and excess dithiothreitol as reductive 4) there was a decreasing tendency of the levels of AA in plasma when combined with a) smoking b) progress of age 5) the levels of AA in non smokers' plasma, are similar in both sexes 6) the levels of AA in smokers' plasma are higher in women, irrespective of age 7) women up the age of 50 have steadily higher level of AA in their polymorphonuclear cells irrespective of smoking or not, probably, because of the existence of high levels of estrogens. On the contrary in ages over 50 years, the differences in the levels of AA found for both sexes are considerably smaller 8) decreased levels of AA in mononuclear cells were observed, only in male smokers of 20-50 years old 9) in non smokers there wasn't found any DHA in polymorphonuclear cells or mononuclear cells.

Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι να βρεθούν οι ιδανικές συνθήκες προσδιορισμού του ΑΑ με HPLC, ώστε να διασφαλιστεί η σταθερότητα, η εξειδίκευση και η ευαισθησία τόσο σε δείγματα πλάσματος, όσο και λευκών αιμοσφαιρίων. Για το λόγο αυτό αναζητήθηκαν οι καταλληλότερες συνθήκες επεξεργασίας των δειγμάτων, ώστε να επιτευχθεί η ποσοτική αναγωγή του DHA. Τέλος, για να αξιολογηθεί η αξιοπιστία και η επαναληψιμότητα της μεθόδου, εφαρμόστηκε σε μεγάλο αριθμό υγιών ατόμων, καπνιστών και μη καπνιστών, δηλαδή σε συνθήκες μεταβαλλόμενης συγκέντρωσης του ΑΑ. H μέθοδος εφαρμόστηκε σε 100 υγιή άτομα, άνδρες και γυναίκες καπνιστές και μη καπνιστές. Τα άτομα χωρίστηκαν σε ομάδες των 10 ατόμων κατά ηλικία (δέκα έτη) και φύλο και προσδιορίστηκε το ΑΑ και το DHA στο πλάσμα και τα λευκά αιμοσφαίρια. Συνοπτικά, τα αποτελέσματα που προέκυψαν από την εργασία μας ήταν: 1) το ΑΑ εμφανίζει μεγαλύτερη σταθερότητα τόσο σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών pH=5, όσο και σε διάλυμα μ-φωσφορικού οξέος 2) η ιδανική μέθοδος προσδιορισμού είναι η HPLC σε συνδυασμό με χρωματογραφική στήλη αντίστροφης φάσης C18 και σε συνδυασμό δύο ανιχνευτών, υπεριώδους φωτός και ηλεκτροχημικού σε σειρά 3) οι βέλτιστες συνθήκες αναγωγής του DHA σε ΑΑ είναι σε pH=7 και περίσσεια διθειοθρεϊτόλης ως αναγωγικό 4) παρατηρήθηκε πτωτική τάση των επιπέδων ΑΑ πλάσματος σε συνδυασμό α) με το κάπνισμα β) με την πρόοδο της ηλικίας 5) οι τιμές του ΑΑ των μη καπνιστών, είναι παρόμοιες και στα δύο φύλα 6) οι τιμές του ΑΑ στο πλάσμα των καπνιστών είναι ψηλότερες στις γυναίκες ανεξαρτήτως ηλικίας 7) στα πολυμορφοπύρηνα οι γυναίκες μέχρι την ηλικία των 50 ετών, έχουν σταθερά υψηλότερα επίπεδα ΑΑ ανεξαρτήτως καπνίσματος, πιθανώς λόγω της ύπαρξης υψηλών επιπέδων οιστρογόνων. Αντίθετα στις ηλικίες άνω των 50 ετών, οι τιμές του ασκορβικού οξέος μεταξύ των δύο φύλων εξισώνονται 8) στα μονοπύρηνα παρατηρήθηκε μείωση των επιπέδων ΑΑ λόγω καπνίσματος μόνο στους άνδρες 20-50 ετών 9) στους μη καπνιστές δεν βρέθηκε DHA στα μονοπύρηνα, ούτε στα πολυμορφοπύρηνα.