Μοριακή έρευνα και επιδημιολογική συσχέτιση στελεχών ψευδομονάδων που παράγουν μεταλλο-β-λακταμάσες

Abstract

160 different species of the large Pseudomonas genus have been described but Clinical Microbiology is only interested in some of them either as natural habitats of the human body, as co-causers of infections or as plain pathogens. P. aeruginosa has long been studied by scientists as a cause of serious infections. It is an opportunistic pathogen which causes infections mostly to immunocompromised patients and is reported to be one of the most common cause of hospital acquired infections. Imipenem and meropenem are b- lactams which belong to carbapenems and are used for the treatment of infections caused by P. aeruginosa either as monotherapy or in combination to other drugs with anti-pseudomonal action. The development of bacterial resistance is a serious threat to the favourable outcome of common infections in community and hospital settings. Bacterial resistance is the result of the development and dissemination of acquired mechanisms of resistance. Mechanisms of resistance which confer acquired resistance of P. aeruginosa to b-lactams, aminoglycosides and polymyxines are: i) enzymatic degradation or modification of the antimicrobial agent, ii) reduced impermeability of the outer membrane, iii) upregulation of efflux pumps, iv) altered targets of antibiotic action. The production of metallo-b-lactamases belongs to the first category, the enzymatic degradation. Metallo-b-lactamases are classified into 5 subgroups which are named IMP, VIM, SPM, GIM and SIM. SPM, GIM and SIM include only one type of enzyme and have been described in America, Germany and Korea respectively. In contrast, VIM and IMP include 22 and 24 enzymes respectively and present worldwide dissemination. Metallo-b-lactamases consist of the most novel mechanism of resistance to imipenem and meropenem. The aim of this thesis was: a) the molecular investigation of metallo-blactamases as an acquired mechanism of resistance to imipenem and meropenem in P. aeruginosa isolates, b) the molecular detection of dissemination of P. aeruginosa isolates with metallo-b-lactamase gene in the nosocomial setting, c) the determination of risk factors for the development of these isolates. For these purposes, a total of 361 clinical isolates of P. aeruginosa were isolated from cultures of specimens collected from hospital patients, personnel and hospital environment. The 106 isolates resistant to imipenem and meropenem (29,3%) were phenotypically tested for the production of metallo-b-lactamase. 35,8% of the resistant strains were positive for the metalloenzyme. All isolates were also tested for their resistance to other antimicrobial agents used for P. aeruginosa. A statistically important difference was observed in resistance to antibiotics between carbapenem resistant and sensitive strains. Specifically, antibiotic resistance between carbapenem resistant and sensitive strains was: Piperacillin (63,2% vs 9,8%), Piperacillin/Tazobactam (34,9% vs 5%), Ceftazidime (74,5% vs 14,9%), Cefepime (72,6% vs 9,4%), Aztreonam (54,7% vs 17,2%), Gentamycin (54,7% vs 14,5%), Amikacin (59,4% vs 10,1%), Tobramycin (66,9% vs 7,8%), Netilmycin (55,6% vs 9,8%), Ciprofloxacin (80,1% to 13,3%), Norfloxacin (82% vs 17,6%), Colistin (8,4% vs 3,5%). Carbapenem resistrant strains were always multidrug resistant. Real-Time PCR and a new protocol was performed based on the needs of this study and thus blaVIM gene was detected in 38 out of 106 isolates of P. aeruginosa resistant to carbapenems (35,8%). This protocol provides the advantage of testing 15 out of 22 blaVIM and 11 out of 24 blaIMP genes in one reaction. Using the DNA Sequencing method it was revealed that in 32 out of 38 isolates blaVIM gene was part of the variable region of the integron class 1. In 28 out of 32 isolates, blaVIM-2 gene co-existed in the variable region of the integron area with an aminoglycoside resistant gene. Integrons are often found in transposons. Transposons are DNA parts having the ability to move from plasmid to plasmid, from plasmid to a phage or from a plasmid to a chromosome with the aid of an enzyme named transposase which is coded by the transposon. Using palse field gel electrophoresis (PFGE), DNA analysis of the isolates which carried the blaVIM gene was performed and the comparison of their electrophoretic profiles showed that four epidemic clones existed with dissemination to different parts and intensive care units of the hospital. Statistical analysis of the patients’ epidemiological data using x² test (Chi-square test) or Fisher’s exact test when the expected frequency number was low (<5), showed that risk factors exist, such as treatment in the intensive care unit, intubation, installation of urocatheters, rhinogastric catheterization, administration of corticosteroids. The presence of these risk factors is crucial for the development of P. aeruginosa strains resistant to carbapenems. Finally, statistical analysis revealed that patient mortality is statistically significantly relevant to infections caused by pseudomonas spp resistant to carbapenems Data produced out of this thesis can significantly contribute to the confrontation of dissemination of the resistant strains and to the reasonable use of carbapenemases in order to retain the efficacy of the drugs.

Στο γένος των ψευδομονάδων έχουν περιγραφεί 160 διαφορετικά είδη, αλλά λίγα (P. aeruginosa, P. fluorescents, P. putida, P. stutzeri, P. mendocina, P. alcaligenes και P. pseudoalgaligenes) ενδιαφέρουν την Κλινική Μικροβιολογία ως αποικιστές του ανθρωπίνου σώματος, ως συμπαράγοντες νόσων ή ως καθαρά παθογόνοι παράγοντες. Η P. aeruginosa είναι το είδος που απασχόλησε εκτενώς τους επιστήμονες ως αίτιο σοβαρών λοιμώξεων. Πρόκειται για ένα ευκαιριακά παθογόνο βακτηρίδιο που προκαλεί λοιμώξεις κυρίως σε ανοσοκατεσταλμένους ασθενείς και συγκαταλέγεται στα πιο συχνά αίτια ενδονοσοκομειακών λοιμώξεων. Η ιμιπενέμη και η μεροπενέμη είναι β-λακταμικά αντιβιοτικά που ανήκουν στις καρβαπενέμες και χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία λοιμώξεων από P. aeruginosa είτε ως μονοθεραπεία, είτε σε συνδυασμό με άλλα αντιβιοτικά τα οποία έχουν αντιψευδομοναδική δράση. Η ανάπτυξη από τα βακτήρια αντοχής στα αντιμικροβιακά φάρμακα αποτελεί σοβαρό εμπόδιο στην αποτελεσματική θεραπεία των λοιμώξεων. Η μικροβιακή αντοχή είναι αποτέλεσμα της δημιουργίας και διασποράς επίκτητων μηχανισμών αντοχής. Οι μηχανισμοί που υποστηρίζουν την επίκτητη αντοχή της P. aeruginosa που αφορά στα β-λακταμικά αντιβιοτικά, στις αμινοιγλυκοσίδες, στις φθοριοκινολόνες και στις πολυμυξίνες, διακρίνονται σε i) παραγωγή αδρανοποιητικών ενζύμων, ii) μειωμένη διαπερατότητα της εξωτερικής μεμβράνης, iii) απορρύθμιση των αντλιών ενεργητικής εκροής και iv) τροποποίηση στόχων δράσης των αντιβιοτικών. Στην κατηγορία των αδρανοποιητικών ενζύμων ανήκει η παραγωγή των μεταλλο-β-λακταμασών. Οι μεταλλο-β-λακταμάσες ταξινομούνται σε 5 υποτάξεις που ονομάζονται IMP, VIM, SPM, GIM και SIM. Οι υποτάξεις SPM, GIM και SIM περιλαμβάνουν μόνο έναν τύπο ενζύμου και έχουν περιγραφεί στην Αμερική , τη Γερμανία και την Κορέα, αντίστοιχα. Αντίθετα, οι υποτάξεις VIM και IMP περιλαμβάνουν 22 και 24 ένζυμα, αντίστοιχα και παρουσιάζουν παγκόσμια διασπορά. Τα μεταλλοένζυμα αποτελούν τον νεώτερο μηχανισμό αντοχής στην ιμιπενέμη και στη μεροπενέμη. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν: α) η μοριακή διερεύνηση των μεταλλο-βλακταμασών ως επίκτητου μηχανισμού αντοχής στην ιμιπενέμη και μεροπενέμη σε στελέχη P. aeruginosa, β) η μοριακή διερεύνηση διασποράς στο νοσοκομειακό χώρο των στελεχών P. aeruginosa με γονίδιο μεταλλο-β-λακταμάσης, και γ) ο προσδιορισμός παραγόντων κινδύνου για την εμφάνιση ανάλογων στελεχών. Για το λόγο αυτό εξετάσθηκαν 361 στελέχη P. aeruginosa, τα οποία απομονώθηκαν από την καλλιέργεια δειγμάτων που λήφθηκαν από ασθενείς, νοσηλευτικό προσωπικό και το χώρο του νοσοκομείου. Τα 106 ανθεκτικά στην ιμιπενέμη και μεροπενέμη στελέχη (ποσοστό 29,3%) εξετάσθηκαν φαινοτυπικά για την παραγωγή μεταλλο-β-λακταμάσης. Ποσοστό 35,8% των ανθεκτικών στελεχών παρήγαγαν μεταλλοένζυμο. Όλα τα στελέχη ελέχθησαν επιπλέον για την αντοχή τους σε σειρά αντιβιοτικών που χρησιμοποιούνται εναντίον της P. aeruginosa. Παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά των ποσοστών αντοχής στα αντιμικροβιακά μεταξύ στελεχών που ήταν ανθεκτικά στις καρβαπενέμες και στελεχών που ήταν ευαίσθητα σ’ αυτές. Πιο αναλυτικά τα ποσοστά αντοχής στα αντιβιοτικά μεταξύ ανθεκτικών και ευαίσθητων στις καρβαπενέμες στελεχών ήταν: Πιπερακιλλίνη (63,2% vs 9,8%), Πιπερακιλλίνη / Ταζομπακτάμη (34,9% vs 5%), Κεφταζιδίμη (74,5% vs 14,9%), Κεφεπίμη (72,6% vs 9,4%), Αζτρεονάμη (54,7% vs 17,2%), Γενταμυκίνη (54,7% vs 14,5%), Αμικασίνη (59,4% vs 10,1%), Τομπραμυκίνη (66,9% ως 7,8%), Νετιλμικίνη (55,6% vs 9,8%), Σιπροφλοξασίνη (80,1% ως 13,3%), Νορφλοξασίνη (82% vs 17,6%), Κολιστίνη (8,4% vs 3,5%). Τα ανθεκτικά στις καρβαπενέμες στελέχη ήταν κατά κανόνα πολυανθεκτικά. Με τη δοκιμασία της Real-Time PCR και την εφαρμογή ενός νέου πρωτοκόλλου, εμπνευσμένο από τις ανάγκες τις μελέτης, ανιχνεύθηκε blaVIM γονίδιο στα 38 από τα 106 (ποσοστό 35,8%) ανθεκτικά στις καρβαπενέμες στελέχη P. aeruginosa. Το πρωτόκολλο δίνει τη δυνατότητα ελέγχου σε μία αντίδραση 15 από τα 22 blaVIM και 11 από τα 24 blaIMP γονίδια. Με τη μέθοδο της αλληλούχισης ( DNA Sequencing) βρέθηκε ότι στα 33 από τα 38 στελέχη (ποσοστό 86,8%) το blaVIM γονίδιο ήταν τμήμα της μεταβλητής περιοχής του ιντεγκρονίου τάξης 1. Στα 28 από τα 33 στελέχη (ποσοστό 84,8%) το blaVIM-2 γονίδιο συνυπήρχε στην μεταβλητή περιοχή του ιντεγκρονίου με γονίδιο αντοχής αμινογλυκοσίδης. Τα ιντεγκρόνια συχνά εντοπίζονται επάνω σε τρανσποζόνια. Τα τρανσποζόνια είναι κομμάτια DNA τα οποία έχουν την ικανότητα να μετακινούνται από πλασμίδιο σε πλασμίδιο, από πλασμίδιο σε βακτηριοφάγο, ή από πλασμίδιο σε χρωμόσωμα, με τη βοήθεια ενός ενζύμου, της τρανσποζάσης, το οποίο κωδικοποιείται από το τρανσποζόνιο. Με τη μέθοδο της ηλεκτροφόρησης σε παλλόμενο ηλεκτρικό πεδίο έγινε ανάλυση του DNA των στελεχών με blaVIM γονίδιο και από τη σύγκριση των ηλεκτροφορητικών αποτυπωμάτων τους προέκυψε ότι υπήρξαν τέσσερις επιδημικοί κλώνοι με διασπορά σε διάφορα τμήματα και μονάδες εντατικής θεραπείας του νοσοκομείου. Η στατιστική ανάλυση επιδημιολογικών δεδομένων των ασθενών, που έγινε με τη δοκιμασία x² (Chi-square test) ή με την ακριβή δοκιμασία Fisher (Fisher’s exact test) όταν ο αναμενόμενος αριθμός συχνοτήτων ήταν μικρός (<5), έδειξε ότι υπάρχουν παράγοντες κινδύνου, όπως η νοσηλεία με μονάδα εντατικής, η διασωλήνωση, η τοποθέτηση ουροκαθετήρα, ρινογαστρικού καθετήρα και η λήψη κορτικοστεροειδών, η παρουσία των οποίων είναι καταλυτική για την εμφάνιση στελεχών P. aeruginosa με αντοχή στις καρβαπενέμες. Τέλος, η στατιστική ανάλυση έδειξε ότι η θνητότητα των ασθενών έχει στατιστικά σημαντική σχέση με λοιμώξεις από ανθεκτικές στις καρβαπενέμες ψευδομονάδες. Συνοψίζοντας καταλήγουμε στα παρακάτω συμπεράσματα: 1. Σε ποσοστό 29,3% τα στελέχη P. aeruginosa ήταν ανθεκτικά στην ιμιπενέμη και μεροπενέμη κατά το χρονικό διάστημα 2003 έως 2005. 2. Σε ποσοστό 35,8% η αντοχή στις καρβαπενέμες οφειλόταν σε παραγωγή VIM-2 μεταλλο-β-λακταμάσης. 3. Σε ποσοστό 86,8% το blaVIM-2 γονίδιο ήταν τμήμα γονιδιακής κασέτας στη μεταβλητή περιοχή ιντεγκρονίου τάξης 1. 4. Σε ποσοστό 84,4% το blaVIM-2 βρέθηκε να συνυπάρχει στη μεταβλητή περιοχή του ιντεγκρονίου με άλλη γονιδιακή κασέτα, η οποία έφερε γονίδιο αντοχής για αμινογλυκοσίδες. 5. Το πρωτόκολλο της Real-Time PCR επιτρέπει την κατά ομάδες ανίχνευση σε μία αντίδραση 15 blaVIM και 11 blaIMP αλληλόμορφων γονιδίων. 6. Οι πιθανότητες μόλυνσης από στελέχη P. aeruginosa με αντοχή στην ιμιπενέμη και μεροπενέμη αυξάνουν όταν συνυπάρχει: α. νοσηλεία σε μονάδα εντατικής θεραπείας β. Διασωλήνωση γ. λήψη κορτικοστεροειδών δ. τοποθέτηση ουροκαθετήρα ε. Τοποθέτηση ρινογαστρικού καθετήρα 7. Η τοποθέτηση ουροκαθετήρα αυξάνει τις πιθανότητες μόλυνσης από στελέχη με γονίδιο μεταλλο-β-λακταμάσης. 8. Τα στελέχη P. aeruginosa με γονίδια μεταλλο-β-λακταμάσης δεν περιορίζονται μόνο σε παθολογικά κλινικά δείγματα, αλλά μπορούν να διασπαρθούν στο χώρο, να αποικίσουν ασθενείς και να προκαλέσουν επιδημίες Τα δεδομένα που προκύπτουν από την παρούσα μελέτη μπορούν να συμβάλουν στον έλεγχο και στην αντιμετώπιση της διασποράς των ανθεκτικών στελεχών P. aeruginosa και στην ορθολογική χρήση των καρβαπενεμών ώστε να διατηρηθεί η αποτελεσματικότητα των φαρμάκων στην θεραπεία ψευδομοναδικών λοιμώξεων.