In vitro μελέτη της επίδρασης της quercetin στα κύτταρα της οξείας μυελογενούς λευχαιμίας

Abstract

Acute myeloid leukemia (AML) at older age is associated with several biologic and clinical characteristics. Hence, it may arise from an early level of hematopoietic stem cells and has a high frequency of blast cells with multidrug resistance glycoprotein MDR1 expression and particularly a high incidence of poor prognostic karyotypes. These factors, rather than age per se, underlie the poorer outcome as compared with younger cases. Therefore, new treatment strategies need to be developed. Today, flavonoids receive the greatest attention as potent anticancer agents. Quercetin (3, 3', 4', 5, 7- pentahydroxyflavone), a common component of our diet, is one of the most studied flavonoids due to its potent antiproliferative effect and ability to induce apoptosis in cancer cell lines. The induction of programmed cell death also known as apoptosis, is the common outcome of successful cytotoxic therapy for many different types of cancer, including AML. Multiple genetic alterations that result in the disruption of the physiological regulation of apoptosis are thought to account for the ability of leukemic cells to grow autonomously and for their clinical resistance to therapy. Recently, a new family of downstream inhibitors of caspases, the IAP (inhibitor of apoptosis protein) family, has emerged as a potential key player in the regulation of apoptosis in cancer. Survivin is a member of the IAP family and a bifunctional protein that suppresses apoptosis and regulates cell division. This protein has garnered great interest as a potential drug target because its expression is among the most tumor-specific of all human gene products. While fetal tissues contain abundant survivin mRNA and protein, most normal adult tissues do not. In contrast, the vast majority of tumors express survivin protein at high levels, suggesting that reactivation of SURVIVIN gene expression occurs commonly in cancers. The aim of this study is to investigate in vitro the effect of quercetin on viability, growth and apoptosis of AML cells from elderly patients, as well as to find out if and how the expression of antiapoptotic protein survivin is affected. For this reason we used long term bone marrow cultures (LTBMCs) from AML patients, where leukemic cells were grown without (control cultures) and with the addition of quercetin at doses of 50 μΜ and 100 μΜ in various time points (24, 48, 72 hours and 1 week). Cell viability was evaluated by double counting of trypan blue dye-excluding cells under a light microscope and cells counts were performed with a hemocytometer. Apoptosis was determined by the use of annexin V expression. Intracellular staining with anti-human survivin monoclonal antibody was used to detect survivin protein. Apoptosis and survivin expression were estimated using flow cytometry after gating on blast population, on the basis of their low SS and CD45 dim staining. We also used short term bone marrow cultures, after quercetin addition on LTBMCs for 24 hours, in order to evaluate the effect of quercetin on progenitor cells. Twenty elderly AML patients (14 with de novo AML and 6 transformed from MDS) were included in this study. The patients (12 men and 8 women), over 60 years of age (mean age 68.8±9.2 years), were at initial stage of AML, without any prior treatment. According to FAB criteria the classification was Μ0: 1, Μ1: 3, Μ2: 8, Μ4: 4, Μ5: 3, Μ6:1. Our results showed: • Quercetin decreased the viability of leukemic cells in a dose and time dependent manner. • Quercetin inhibited the growth of leukemic cells in a dose and time dependent manner. • Quercetin increased apoptosis of leukemic cells in a dose and time dependent manner. • All the AML patients expressed the survivin protein. • Quercetin enhanced the expression of the antiapoptotic protein survivin in leukemic cells in a dose dependent • Quercetin decreased the number of colonies, especially at the dose of 100 μΜ. In conclusion, it is obvious from this study that although the mechanism of action of quercetin is not clear, it is certain that this substance promotes apoptosis of leukemic cells. Given that many chemotherapeutic agents act via apoptosis induction, it is possible that compounds such as quercetin would have greater antileukemic efficacy if combined with conventional cytotoxic chemotherapy.

Η οξεία μυελογενής λευχαιμία (ΟΜΛ) στους ηλικιωμένους ασθενείς συνδέεται με ορισμένα βιολογικά και κλινικά χαρακτηριστικά. Προκαλείται από κλωνική διαταραχή των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων, συνοδεύεται από μεγάλο αριθμό βλαστικών κυττάρων που διηθούν το μυελό και το αίμα και εκφράζουν πολυφαρμακευτική ανθεκτικότητα, ενώ εμφανίζει ιδιαίτερα αυξημένο αριθμό καρυοτύπων πτωχής πρόγνωσης. Αυτά τα χαρακτηριστικά και όχι τόσο η ηλικία αυτή καθαυτήν, οδηγούν στο πτωχότερο θεραπευτικό αποτέλεσμα σε σχέση με τους νεότερους ασθενείς. Καθίσταται λοιπόν αναγκαίο να βρεθούν νέες θεραπευτικές στρατηγικές προσέγγισης των ασθενών αυτών για τη βελτίωση της πρόγνωσης και της αντιμετώπισής τους. Σήμερα τα φλαβονοειδή κερδίζουν μεγάλη αποδοχή ως πιθανοί αντικαρκινικοί παράγοντες. Η quercetin (3, 3', 4', 5, 7-πεντοϋδροξυφλαβόνη) ένα κοινό συστατικό της διατροφής μας είναι το πλέον μελετημένο φλαβονοειδές λόγω της ισχυρής αντιπολλαπλασιαστικής της δράσης σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές σειρές και της ικανότητάς της να αυξάνει την απόπτωση σ' αυτές. Η έναρξη του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου γνωστή και ως απόπτωση, είναι η κοινή έκβαση της επιτυχημένης κυτταροτοξικής θεραπείας διαφόρων τύπων καρκίνου συμπεριλαμβανομένης και της ΟΜΛ. Πολλαπλές γενετικές μεταβολές που έχουν ως αποτέλεσμα την απορρύθμιση της φυσιολογικής απόπτωσης, πιστεύεται ότι οφείλονται στην ικανότητα των λευχαιμικών κυττάρων να πολλαπλασιάζονται αυτόνομα και να αντιστέκονται στη θεραπεία. Πρόσφατα, μια νέα οικογένεια αναστολέων των κασπασών, η οικογένεια των IAPs (inhibitor of apoptosis proteins), εμφανίστηκε ως ένας σημαντικός παράγοντας για τη ρύθμιση της απόπτωσης στον καρκίνο. H survivin ανήκει στην οικογένεια των IAPs και είναι μια πρωτεΐνη με διττό ρόλο, που καταστέλλει την απόπτωση και ρυθμίζει την κυτταρική διαίρεση. Η πρωτεΐνη αυτή έχει κερδίσει μεγάλο ενδιαφέρον, θεωρούμενη θεραπευτικός στόχος λόγω του γεγονότος ότι η έκφρασή της είναι από τις πλέον ογκο-ειδικές πρωτεΐνες. Σημαντικό είναι ότι το mRNA και η πρωτεΐνη της survivin εκφράζονται έντονα από τους εμβρυϊκούς ιστούς ενώ δεν εκφράζονται από τους περισσότερους ενηλίκους ιστούς. Σε αντίθεση, η πλειονότητα των κακοηθειών εκφράζει την πρωτεΐνη της survivin σε υψηλά επίπεδα, γεγονός που υπαινίσσεται την ενεργοποίηση του γονιδίου SURVIVIN. Σκοπός της εργασίας αυτής είναι να μελετήσουμε in vitro την επίδραση της quercetin στη βιωσιμότητα, στην ανάπτυξη και στην απόπτωση των κυττάρων ηλικιωμένων ασθενών με ΟΜΛ, καθώς επίσης εάν και κατά πόσο επηρεάζεται η έκφραση της αντιαποπτωτικής πρωτεΐνης survivin από αυτήν. Για το σκοπό αυτό εφαρμόσαμε υγρές καλλιέργειες μυελού των οστών ασθενών με ΟΜΛ, στις οποίες τα λευχαιμικά κύτταρα αναπτύσσονταν χωρίς (καλλιέργειες μάρτυρες) και με την επίδραση της quercetin σε δόσεις των 50 μΜ και 100 μΜ, σε διαφορετικά χρονικά διαστήματα (24, 48, 72 ώρες και 1 εβδομάδα) και εκτιμήθηκε η βιωσιμότητα των κυττάρων. Η απόπτωση προσδιορίστηκε με τη χρήση της έκφρασης της αννεξίνης V. Για τον προσδιορισμό της ενδοκυττάριας πρωτεΐνης survivin χρησιμοποιήθηκε το μονοκλωνικό αντίσωμα anti-human survivin. Η απόπτωση και η έκφραση της survivin εκτιμήθηκαν με τη μέθοδο της κυτταρομετρίας ροής. Mετά την επίδραση της quercetin στις υγρές κυτταροκαλλιέργειες για 24 ώρες, εφαρμόσαμε ημίρρευστες κυτταροκαλλιέργειες, ώστε να ερευνηθεί η επίδραση της ουσίας στα δεσμευμένα προγονικά κύτταρα. Μελετήθηκαν 20 ηλικιωμένοι ασθενείς με ΟΜΛ, αμέσως μετά τη διάγνωση και πριν από τη χορήγηση οποιασδήποτε αγωγής, ηλικίας άνω των 60 ετών (μέση ηλικία 68,8 ± 9,2 έτη), από τους οποίους οι 14 είχαν de novο ΟΜΛ και οι 6 δευτεροπαθή μετά από ΜΔΣ. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η quercetin προκαλούσε, με ένα δοσο- και χρονο-εξαρτώμενο τρόπο, ελάττωση της βιωσιμότητας, αναστολή του πολλαπλασιασμού και αύξηση της απόπτωσης των λευχαιμικών κυττάρων. Όλοι οι ασθενείς με ΟΜΛ εξέφραζαν την πρωτεΐνη της survivin. Η quercetin προκαλούσε αύξηση της έκφρασης της αντι-αποπτωτικής πρωτεΐνης survivin στα λευχαιμικά κύτταρα με ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο όπως επίσης και μείωση του αριθμού των αποικιών, ιδιαίτερα στη δόση των 100 μΜ. Συμπερασματικά, από τη μελέτη αυτή προκύπτει ότι αν και δεν έχει καθοριστεί επακριβώς ο μηχανισμός της δράσης της quercetin έχει διαπιστωθεί ότι η ουσία αυτή προάγει την απόπτωση των λευχαιμικών κυττάρων. Δεδομένου ότι αρκετοί χημειοθεραπευτικοί παράγοντες δρουν μέσω της έναρξης της απόπτωσης, είναι δυνατόν χημικές ουσίες όπως η quercetin να προκαλούν μεγαλύτερη αντιλευχαιμική δράση εάν συνδυαστούν με τη συμβατική κυτταροτοξική θεραπεία.