Μοριακός χαρακτηρισμός, εξελικτικές σχέσεις και ανίχνευση ιών της αμπέλου ενός διακριτού φυλογενετικού κλάδου του γένους ampelovirus και εξυγίανση πολλαπλασιαστικού υλικού

Abstract

During the last decades new leafroll associated viruses (GLRaVs) have been isolated from grapevine. As a result GLRaVs were raised to 9 while two new isolates (temporary designations GLRaV-Pr and GLRaV-De) were recently determined from Greek grapevine varieties. The majority of these viruses are classified within the recently established genus Ampelovirus of the family Closteroviridae. Based on phylogenies of partial HSP70h sequences, GLRaV-4, -5, -6, -9, -Pr and -De were found to be more closely related to each other compared to the other GLRaVs. This virus group that includes most of the GLRaVs is barely studied, with problems on their characterization, taxonomy and detection. In this study the evolutionary relationships of this virus group were studied based on molecular variability, positive selection analysis and maximum likelihood (ML) phylogenies. Additional sequences from different isolates were determined and datasets corresponding to the N terminal HSP70h and full CP genes were analysed. ML topologies established the closer phylogenetic relationships of GLRaV-4, -5, -6, -9, -Pr and GLRaV-De in regard to the other ampeloviruses, revealing very low inter-species evolutionary distances. The HSP70h phylogeny and bootstrap analysis enabled the identification of species providing a useful taxonomic tool for their rapid demarcation. dN/dS estimations showed that, within the Closteroviridae, these viruses are subjected to the strongest constraints against amino acid substitutions demonstrating a distinct evolutionary trait for this lineage probably related to its particular niche that involves successful adaptation to the host, transmission through vegetative propagation and lack of highly efficient vectors. The HSP70h data set obtained in this study was used for designing new primers, which were applied in nested PCR assays, for the generic detection of members of this lineage and the specific diagnosis of each virus-species. The developed detection scheme is proposed as a tool that can be used in routine screening and certification schemes and could be useful for the enrichment of sequence information of known and novel ampeloviruses, classified within this lineage, enabling their selective amplification in mixed Closteroviridae virus infections. The genomes of GLRaV-Pr and GLRaV-De were further determined using isolated viral dsRNA. GLRaV-Pr is the first fully sequenced grapevine virus of subgroup I ampeloviruses. Its nucleotide sequence is 13,696 nucleotides long, one of the smallest in the Closteroviridae, and contains 7 ORFs which potentially encode a 253 kDa polyprotein, a 58,2 kDa RdRp, a 5,2 kDa protein (p5), a 58,5 kDa HSP70h, a 60 kDa protein (p60), a 30 kDa CP and a protein of 23 kDa (p23). A specific polyclonal antibody was raised against the recombinant GLRaV-Pr CP and was evaluated in different serological assays. A 4,319 nucleotides region corresponding to the HSP70h, p60, CP and p23 (partial) genes was also determined for GLRaV-De. GLRaV-Pr and -De differ by more than 10% in amino acids from the known closely related species. This along with their serological differentiation, genome organization and phylogenetic analysis support their future assignment as tentative species. Comparisons of GLRaV-Pr with the only available genetically related fully sequenced PMWaV-1, PBNSPaV and the partially sequenced GLRaV-9 revealed that, within the genetically diverse genus of ampeloviruses, this lineage of closely related species exhibits high uniformity on genome organization including the smallest and simplest viruses within the Closteroviridae. This observation coupled by Maximum likelihood and Bayesian analysis topologies of the most evolutionary conserved HEL, RdRp and HSP70h proteins obtained herein, confirm that these species follow a distinct evolutionary course and are substantially differentiated from the other virus species classified within the genus Ampelovirus. Consequently, this lineage could in the future constitute a new separate genus. Finally, studies were carried out to eliminate GLRaV-Pr and GRSPaV (Flexiviridae) in two wine cultivars, Mantilaria and Prevezaniko. Virus elimination was achieved by combining in vitro thermotherapy and shoot tip culture. The results confirmed that virus elimination in grapevine is easier to occur on species of the Closteroviridae family than on GRSPaV.

Τα τελευταία χρόνια πολλοί νέοι ιοί σχετιζόμενοι με την ασθένεια συστροφής των φύλλων της αμπέλου (Grapevine leafroll associated viruses, GLRaVs) απομονώθηκαν παγκοσμίως από διάφορες ποικιλίες. Μέχρι πρόσφατα αυτοί οι ιοί ανέρχονταν στους 9, ενώ άλλες δύο απομονώσεις (προσωρινές ονομασίες GLRaV-Pr και GLRaV-De) προσδιορίστηκαν επίσης από Ελληνικές ποικιλίες αμπέλου. Οι περισσότεροι από αυτούς τους ιούς κατατάσσονται στο νέο-ιδρυθέν γένος Ampelovirus της οικογένειας Closteroviridae. Mε βάση φυλογενετικές αναλύσεις αλληλουχιών τμήματος της ομόλογης HSP70 πρωτεΐνης (HSP70h) oι GLRaV-4, -5, -6, -9, -Pr και -De σχετίζονται περισσότερο μεταξύ τους σε σχέση με τους άλλους GLRaVs. Αυτή η ομάδα ιών, που περιλαμβάνει τους περισσότερους GLRaVs, είναι ελάχιστα μελετημένη, με προβλήματα στον χαρακτηρισμό, την ταξινόμηση και την ανίχνευσή τους. Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκαν οι εξελικτικές σχέσεις αυτών των ιών με τη βοήθεια αναλύσεων γενετικής παραλλακτικότητας, θετικής επιλογής και φυλογενειών μέγιστης πιθανοφάνειας (Maximum Likelihood, ML). Προσδιορίστηκαν νέες γενετικές πληροφορίες και αναλύθηκαν ομάδες αλληλουχιών από την HSP70h (Ν-τελικό τμήμα) και την CP για διάφορα μέλη της ομάδας. Οι ML τοπολογίες επιβεβαίωσαν τις στενές φυλογενετικές σχέσεις των GLRaV-4, -5, -6, -9, -Pr και GLRaV-De (Υποομάδα Ι) σε σχέση με τους άλλους ampelo-ιούς και αποκάλυψαν την παρουσία πολύ μικρών δια-ειδικών εξελικτικών αποστάσεων. Η φυλογένεια τμήματος της HSP70h, συνοδευόμενη από ανάλυση bootstrap, διευκόλυνε την αναγνώριση ειδών μέσα στην ομάδα, ενώ ταυτόχρονα παρέχει ένα χρήσιμο εργαλείο για τη ταχεία ταξινόμηση των παραπάνω ιών. Οι υπολογισμοί των dN/dS έδειξαν ότι, μέσα στην Closteroviridae, οι ιοί αυτοί υπόκεινται στους πιο ισχυρούς περιορισμούς αντικατάστασης αμινοξέων. Τα αποτελέσματα των παραπάνω υπολογισμών δείχνουν μια ανεξάρτητη εξελικτική πορεία για τους ιούς-μέλη της ομάδας, που πιθανώς σχετίζεται με την ξεχωριστή της οικοθέση, η οποία αφορά επιτυχή προσαρμογή στον ξενιστή, μετάδοση με αγενή πολλαπλασιασμό και απουσία φορέων με μεγάλη αποτελεσματικότητα μετάδοσης. Η ομάδα αλληλουχιών της HSP70h χρησιμοποιήθηκε για το σχεδιασμό νέων εκκινητών, οι οποίοι εφαρμόστηκαν σε δοκιμές ένθετης PCR, για τη γενική ανίχνευση ιών-μελών αυτής της γενεαλογίας και την ειδική διάγνωση κάθε είδους. Το διαγνωστικό σχήμα που αναπτύχθηκε εδώ προτείνεται ως ένα εργαλείο που μπορεί να εφαρμοστεί σε ελέγχους ρουτίνας, συστήματα πιστοποίησης αλλά και για τον εμπλουτισμό των γενετικών πληροφοριών ήδη γνωστών ή και νέων ampelo-ιών, που κατατάσσονται σ’ αυτή τη γενεαλογία, μέσω της επιλεκτικής ενίσχυσής τους σε μικτές μολύνσεις με άλλους ιούς της οικογένειας Closteroviridae. Τα γονιδιώματα των GLRaV-Pr και GLRaV-De προσδιορίστηκαν περαιτέρω χρησιμοποιώντας ιικό dsRNA. Ο GLRaV-Pr είναι ο πρώτος πλήρως χαρακτηρισμένος ιός της αμπέλου της υποομάδας Ι του γένους Ampelovirus, με μήκος γονιδιώματος 13.696 νουκλεοτίδια, ένα από τα μικρότερα στην οικογένεια Closteroviridae. Περιλαμβάνει 7 ΑΠΑ που δυνητικά κωδικοποιούν μια πολυπρωτεΐνη (253 kDa), μια RdRp (58,2 kDa), μια υδρόφοβη πρωτεΐνη (5,2 kDa), μία HSP70h (58,5 kDa), μια πρωτεΐνη 60 kDa (p60), μια CP (30 kDa) και μια πρωτεΐνη μεγέθους 23 kDa (p23). Στα πλαίσια χαρακτηρισμού του GLRaV-Pr παράχθηκε ειδικό αντίσωμα εναντίον της ανασυνδυασμένης CP του ιού και αξιολογήθηκε σε διάφορες ορολογικές δοκιμές. Επίσης, προσδιορίστηκε ένα τμήμα μήκους 4.319 νουκλεοτιδίων της γονιδιωματικής ακολουθίας του GLRaV-De που αντιστοιχεί στις περιοχές που κωδικοποιούν την HSP70h, την p60, την CP και τμήμα της p23. Οι GLRaV-Pr και -De διαφέρουν πάνω από 10% σε επίπεδο αμινοξέων από τους γνωστούς συγγενικούς ιούς.