Χαρακτηρισμός και ανάπτυξη μεθόδων ανίχνευσης ιών του γένους Closterovirus, Foveavirus και Vitivirus σε φυτικούς ιστούς αμπέλου

Abstract

Η σπουδαιότητα της αμπελοκαλλιέργειας στην Ε.Ε. και την Ελλάδα ειδικότερα, σε συνδυασμό με τις επερχόμενες αλλαγές και αυξημένες απαιτήσεις στο χώρο της πιστοποίησης πολλαπλασιαστικού υλικού καθιστούν αναγκαία την ύπαρξη αξιόπιστων τεχνικών για την ανίχνευση αλλά και τον χαρακτηρισμό των ιών της αμπέλου. Παρά την εντυπωσιακή αύξηση των γνώσεων τα τελευταία χρόνια σε ότι αφορά την αιτιολογία της συστροφής των φύλλων και της βοθρίωσης του ξύλου της αμπέλου, ο μεγάλος αριθμός των ιών που σχετίζονται με τις ασθένειες αυτές και τα μειονεκτήματα των διάφορων δοκιμών ανίχνευσης/ταυτοποίησης, καθιστούν τον έλεγχο του πολλαπλασιαστικού υλικού μια διαδικασία σύνθετη, συχνά με μικρή αξιοπιστία, επίπονη, χρονοβόρα, και με υψηλό κόστος. Επίσης, η συνεχιζόμενη ανακάλυψη νέων clostero-και viti-ιών δείχνει ότι στην αιτιολογία των ασθενειών εμπλέκονται και άλλοι άγνωστοι ιοί που ανήκουν στα γένη αυτά και για τα οποία προς το παρόν δεν υπάρχει δυνατότητα ανίχνευσης. Αντικείμενο της διδακτορικής διατριβής ήταν η ανάπτυξη αξιόπιστων μεθόδων ανίχνευσης καθώς και ο χαρακτηρισμός νέων άγνωστων ιών που σχετίζονται με τη συστροφή των φύλλων και τη βοθρίωση του ξύλου της Αμπέλου. Αρχικά, έγινε έλεγχος πρέμνων αμπέλου προερχόμενων από κλωνική επιλογή για την παρουσία ιών που σχετίζονται με τις δύο αυτές ασθένειες, με τις διαθέσιμες ορολογικές και μοριακές και τεχνικές, με στόχο τη συλλογή απομονώσεων ιών των γενών Closterovirus, Foveavirus και Vitivirus. Στη συνέχεια, αναπτύχθηκε μια μέθοδος πολλαπλής εστιασμένης RT-PCR η οποία χρησιμοποιεί εκκινητές με εκφυλισμό, για την ταυτόχρονη ανίχνευση ιών που ανήκουν στα γένη Foveavirus και Vitivirus. Η μέθοδος αυτή συνδυάσθηκε με μια απλουστευμένη και αξιόπιστη μέθοδο επεξεργασίας των δειγμάτων (αποτύπωση εκχυλίσματος φυτικού χυμού σε νάιλον μεμβράνη) και με μια δοκιμή, ανιχνεύει ταυτόχρονα τους RSPaV-1, GVA, GVB, και GVD στο αμπέλι, ενώ θεωρητικά είναι δυνατή η ανίχνευση και άλλων μελών που ανήκουν στα γένη Foveavirus και Vitivirus και προσβάλλουν άλλους ξενιστές. Επίσης, αναπτύχθηκε μια ακόμη μέθοδος πολλαπλής εστιασμένης RT-PCR για την ταυτόχρονη ανίχνευση ιών που ανήκουν στα γένη Closterovirus, Foveavirus και Vitivirus όπου μαζί με τους εκφυλισμένους εκκινητές που περιέχουν δεοξυινοσίνη, χρησιμοποιούνται αντίστοιχοι