Χαρακτηρισμός των ολιγοκλωνικών ζωνών του εγκεφαλονωτιαίου υγρού σε σκλήρυνση κατά πλάκας

Abstract

Cloning of CNS-IgG (central nervous system-IgG) in multiple sclerosis (MS) has revealed features of antigen-specific driven response. The screening of CSF-derived (cerebrospinal fluid) and brain-eluted IgGs from MS cases, with random peptide libraries (RPLs), resulted to specifically reactive peptides (5 and 20 respectively) of determined composition by DNA sequencing. Proper CLUSTALW sequence-alignment revealed lack of comprehensive motif for the CSF-IgG-reactive peptides, and the motifs VKxPNxL, LKQSNADAARFG and SKSNIL for the brain-eluted IgG-reactive peptides. BLASTP homology searches detected numerous viruses relevant to MS, while Human Herpes 3 and 5, and Epstein-Barr viral proteins revealed homology with all the tested sequences-motifs. In order to predict the 2D and 3D structure of each of the 25 peptides, an Ab initio approach was developed, using the known structure of the MOG38-51 peptide (potential MS autoantigen) as control. The predictions utilising the Vistraj software, led to rough but reliable 3D-presentations, which seem to agree with, and at the same time complete, the alignment epitope determination, suggesting the major contact residues of each peptide. This combination of laboratory-bioinformatics approaches enabled an accurate, automated detection of possible infectious agent(s) in MS, as well as the prediction of architectural aspects of their epitope. The strategy gives the potential to address the question regarding the antigenic specificity of intrathecal IgG in MS, while, through the 3D-structural epitope prediction, it gives a starting point for the future design of a reagent, that would mimic effectively the action of IgG in the course of MS.

Η μελέτη κλώνων του ΚΝΣ-IgG (κεντρικού νευρικού συστήματος-IgG) στη σκλήρυνση κατά πλάκας (ΣΚΠ) έχει φανερώσει χαρακτηριστικά εξειδικευμένης απόκρισης ενάντια σε αντιγονική παρουσία. Τα πειράματα βιοεπιλογής για IgG προερχόμενο από ΕΝΥ (εγκεφαλονωτιαίο υγρό)-ΣΚΠ και εγκέφαλο-ΣΚΠ, με τυχαίες πεπτιδικές βιβλιοθήκες (random peptide libraries, RPLs), απέδωσαν συγκεκριμένα πεπτίδια (5 και 20 σε αριθμό αντίστοιχα) που αναγνωρίζονται και προσδένονται από τα υπό μελέτη αντισώματα. Η αλληλουχία των πεπτιδίων προσδιορίστηκε με τη μέθοδο του «DNA sequencing». Η παράταξη των αλληλουχιών τους βάση κοινών αμινοξέων με τη χρήση του λειτουργικού CLUSTALW φανέρωσε έλλειψη ενός κοινού μοτίβου αλληλουχίας για τα πεπτίδια που αντέδρασαν με το ΕΝΥ-IgG, ενώ απέδωσε τα μοτίβα VKxPNxL, LKQSNADAARFG και SKSNIL για τα πεπτίδια που αντέδρασαν με το IgG προερχόμενο από εγκέφαλο. Μέσω της έρευνας για ομόλογες πρωτεϊνικές αλληλουχίες με τη χρήση του λειτουργικού BLASTP εντοπίστηκαν πολυάριθμοι ιοί που έχουν συσχετισθεί επίσημα με τη ΣΚΠ, ενώ ιοικές πρωτεΐνες των ερπητοϊών Human Herpes 3 και 5, και Epstein-Barr παρουσίασαν ομολογίες με όλες τις υπό μελέτη αλληλουχίες-μοτίβα. Με σκοπό την πρόβλεψη της δυσδιάστατης (2D) και τρισδιάστατης (3D) δομής καθενός από τα 25 πεπτίδια της μελέτης, αναπτύχθηκε μία «Ab initio» μεθοδολογία, χρησιμοποιώντας τη γνωστή δομή του πεπτιδίου MOG38-51 (δυνητικό αυτοαντιγόνο στη ΣΚΠ) ως μοντέλο. Οι δομικές προβλέψεις που προέκυψαν με τη χρήση του προγράμματος Vistraj, ήταν αξιόπιστες προσεγγίσεις της 3D δομής κάθε πεπτιδίου, που φαίνεται να συμφωνούν και ταυτόχρονα να συμπληρώνουν τον προσδιορισμό δυνητικών επίτοπων μέσω της τεχνικής της παράταξης πεπτιδικών αλληλουχιών, προτείνοντας τα κύρια αμινοξέα πρόσδεσης κάθε πεπτιδίου. Αυτός ο συνδυασμός εργαστηριακών μεθόδων με τεχνικές βιοπληροφορικής επέτρεψε έναν ακριβή, αυτοματοποιημένο εντοπισμό δυνητικών παραγόντων μόλυνσης στη ΣΚΠ, καθώς και την πρόβλεψη βασικών χαρακτηριστικών της δομής των επιτόπων τους. Η στρατηγική αυτή επιτρέπει την προσέγγιση του ερωτήματος που αφορά στην αντιγονική εξειδίκευση του ΚΝΣ-IgG στη ΣΚΠ, ενώ, μέσω της 3D-δομικής πρόβλεψης των δυνητικών αυτών επίτοπων, δίνει το έναυσμα για το μελλοντικό σχεδιασμό ενός αντιδρώντος πρωτεϊνικού μορίου, που θα μπορούσε να μιμηθεί αποτελεσματικά τη δράση του αντισώματος IgG στην πορεία της ΣΚΠ.