Ενζυμική σύνθεση ακυλιωμένων παραγώγων φυσικών αντιοξειδωτικών σε μη συμβατικά συστήματα. Αξιολόγηση της βιολογικής και αντιοξειδωτικής τους δράσης

Abstract

The present PhD thesis focuses on the enzymatic synthesis of acylated derivatives of natural antioxidants with fatty acids in non-conventional media. The purification of the synthesized products and the evaluation of their biological properties were also studied. A single-step acylation of the flavonoids rutin and naringin, with mono and polyunsaturated fatty acids was performed using an immobilized Candida antarctica lipase in non-toxic organic solvents. The influence of the reaction parameters on the performance of the biocatalytic process was pointed out using the acylation of rutin with oleic acid as a model reaction. The aim of this study was to find the optimal reaction parameters for the acylation of rutin and naringin to prepare esters in high yield. The effect of the quantity of lipase, the water content, the temperature, the molar ratio of flavonoid to acyl donor, as well as the nature of the acyl donor and the nature of the solvent were investigated. Under the optimal conditions found, the esters of rutin and naringin with oleic acid, linoleic acid, ethyl linoleate acid and γ-linolenic acid were obtained The enzymatic acylation of rutin and naringin is regioselective since only monoesters were identified. The purification of the flavonoid esters produced by large scale enzymatic production was studied. The chemical structure of the flavonoid esters was determined by spectroscopic techniques. The antioxidant activities of the novel compounds were evaluated for their capacity to scavenge DPPH radicals. Additionally, the ability of both flavonoids and their esters to modulate the secretion of vascular endothelial growth factor (VEGF), a major regulator of tumor-induced angiogenesis, was examined in K562 lymphoblastoma cell line. Compared to the effect of parental molecules, rutin and individual fatty acids, the synthesized esters were more efficient in reducing the release of VEGF from K562 cells, indicating that they might possess improved anti-angiogenic and anti-tumor properties. Moreover, the flavonoids and the prepared products were studied to identify their apoptosis-inducing activities in K562 cells and their ability to inhibit proliferation of cancer cells.

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκε η ενζυμική σύνθεση ακυλιωμένων παραγώγων φυσικών αντιοξειδωτικών φαρμακολογικού ενδιαφέροντος με λιπαρά οξέα, σε μη συμβατικά συστήματα. Ακολούθησε η απομόνωση των παραγώγων και η αξιολόγηση της βιολογικής και αντιοξειδωτικής δράσης τους, με στόχο την παραγωγή προϊόντων με βελτιωμένες ιδιότητες. Με τη χρήση της ακινητοποιημένης λιπάσης από Candida αntarctica πραγματοποιήθηκε επιτυχώς η εκλεκτική ακυλίωση σε ένα στάδιο των φλαβονοειδών ρουτίνη και ναριγκίνη με ελεύθερα μονο- και πολυ-ακόρεστα λιπαρά οξέα σε οργανικά μέσα. Εξετάστηκαν οι κύριοι παράγοντες που επηρεάζουν την πορεία της εστεροποίησης χρησιμοποιώντας ως αντίδραση αναφοράς την εστεροποίηση της ρουτίνης με το ελαϊκό οξύ. Η έρευνα αυτή είχε ως αποτέλεσμα την εύρεση των καταλληλότερων συνθηκών αντίδρασης (η ποσότητα του ενζύμου, η περιεκτικότητα του νερού, η θερμοκρασία, η μοριακή αναλογία φλαβονοειδούς/λιπαρού οξέος) με σκοπό την αύξηση της παραγωγής των εστέρων. Στα πλαίσια της βελτιστοποίησης των παραμέτρων που επηρεάζουν την αντίδραση μελετήθηκε η επίδραση του ακυλοδότη και του ακυλοδέκτη που χρησιμοποιήθηκαν, καθώς και η φύση του διαλύτη στην απόδοση της μετατροπής των φλαβονοειδών. Παράλληλα, έγιναν δοκιμές με ακινητοποιημένο υπόστρωμα (φλαβονοειδές). Οι πιο ευνοϊκές συνθήκες εφαρμόστηκαν στην αντίδραση της ρουτίνης και της ναριγκίνης τόσο με ελαϊκό οξύ (μονοακόρεστο οξύ), όσο και με λινελαϊκό οξύ, αιθυλεστέρα του λινελαϊκού οξέος και με γ-λινολενικό οξύ (πολυακόρεστα οξέα). Η ενζυμική ακυλίωση τόσο της ρουτίνης όσο και της ναριγκίνης είναι τοποεκλεκτική εφόσον μόνο μονοεστέρες ταυτοποιήθηκαν. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε η απομόνωση των εστέρων που παρήχθησαν από μεγάλης κλίμακας ενζυμικές αντιδράσεις και ακολούθησε η ταυτοποίηση των καθαρών προϊόντων. Προσδιορίστηκε η αντιοξειδωτική δράση των νέων προϊόντων, ελέγχοντας την ικανότητά τους να δρουν ως δεσμευτές ριζών. Μελετήθηκε η επίδραση των ενώσεων αυτών ως πρόσθετα στην αυτοοξείδωση του βαμβακελαίου. Εξετάστηκε η ικανότητα τόσο των μη τροποποιημένων φλαβονοειδών, όσο και των εστέρων τους να δρουν ως αντικαρκινικοί και αντιαγγειογενετικοί παράγοντες. Μελετήθηκε η ικανότητα των ουσιών αυτών να ρυθμίζουν την έκκριση του ενδοθηλιακού αγγειακού αυξητικού παράγοντα, του VEGF, ενός κύριου ρυθμιστή της αγγειογένεσης, στην K562 λεμφοβλαστοματική κυτταρική σειρά. Εξετάστηκε η ικανότητα των μητρικών ενώσεων και των παραγώγων να επάγουν την απόπτωση των K562 κυττάρων και να αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό τους.