Μελέτη της βιολογικής λειτουργίας του ενδοκυττάριου παράγοντα ELAV1 / HuR με χρήση διαγονιδιακών τεχνολογιών επιλεκτικής ρύθμισης

Abstract

The post-transcriptional control of gene expression is currently emerging as a key process for the timely and homeostatic production of important molecules that govern an elicited cellular response. In simple terms, post-transcriptional mechanisms encompass a series of steps that determine mRNA fate (stability, localization, translation) and are governed by the dynamic interactions of RNA binding proteins with their mRNA targets. Failure to regulate a post-transcriptional process can result in aberrant cellular responses and provide the impetus for pathology, as has been exemplified in chronic inflammatory and autoimmune disorders. In the current thesis we focus on the functional analysis of a post- transcriptional regulator called HuR (or HuA/Elavl1). Prior knowledge has suggested that this RNA binding protein has a high affinity for inflammatory and stress- responsive mRNAs that contain a specific motif in their untranslated regions called the AU-rich element (ARE). In vitro studies have shown that in innate cells, bacterial or other inflammatory stimuli induce the binding of HuR to numerous ARE containing cytokine mRNAs to increase their stability and consequently their translation. Moreover, numerous clinical studies have correlated the abnormal expression of HuR with the development of severe immune pathologies. However the functional role of this molecule in the determination of in vivo physiological and pathological cellular responses was lacking. In the context of the work described we focus on the functional analysis of HuR in vivo using conditional transgenic methodologies in the mouse. In our first series of analyses, we focus on the role of this molecule in the modulation of innate responses through its transgenic overexpression in differentiated macrophage subpopulations and in a temporally-restricted fashion. This allowed for the direct assessment of HuR’s functions in the induction of rapid inflammatory gene expression programs and in direct correlation with pathogenic inflammatory responses in vivo. Contrary to expectations, HuR over-expression in macrophages induced the translational silencing of specific cytokine mRNAs, despite positive or nominal effects on their corresponding turnover. Furthermore and using mice with additional deletions in the inflammation related RNA binding proteins TIA-1 and TTP and a model system of ARE-dysfunction, we demonstrated a homeostatic hierarchy in the control of inflammation, in which HuR synergizes with the translational silencer TIA-1 to reduce the translation of cytokine mRNAs, prior to their destruction by TTP. Our data suggest that HuR acts in a pleiotropic fashion in inflammation through its functional interactions with specific mRNA subsets and negative posttranscriptional modules. Most importantly, the clinical significance of this hierarchy was exemplified by the anti-inflammatory properties of the transgenic HuR in vivo and indicates that strategies aiming in the modulation of HuR may have a potential clinical benefit in inflammation. The pleiotropy of HuR functions was further revealed in a second transgenic system developed to analyse the physiological role of this molecule via its gene targeted ablation. Through this platform, a HuR deficient mouse was generated which indicated the important role of HuR in embryonic development and particularly during placentation and gastrulation. Most importantly, the mutant HuR allele that has been generated allows also for the tissue specific deletion of HuR in several pathophysiologically important sites. It is anticipated that the animal systems generated herein coupled to future cellular and molecular analysis will (a) provide new animal models of pathogy, (b) identify new genetic pathways with dominant contributions to pathology, (c) disclose putative therapeutic targets and diagnostic tools and (d) provide basic knowledge on fundamental mechanisms of gene expression.

Ο μεταμεταγραφικός έλεγχος της γονιδιακής έκφρασης αποτελεί ένα θεμελιώδη ενδοκυττάριο μηχανισμό καθορισμού του ρυθμού της πρωτεϊνοσύνθεσης που αποσκοπεί στην έγκαιρη κυτταρική απάντηση, ενώ παράλληλα συμβάλει στη διατήρηση της ομοιόστασης. Πιο συγκεκριμένα, οι μεταμεταγραφικοί μηχανισμοί περιλαμβάνουν μια σειρά διαδικασιών οι οποίες καθορίζουν τα επιμέρους στάδια του μεταβολισμού του mRNA (σταθερότητα, υποκυτταρικός εντοπισμός, μετάφραση) και ελέγχονται από τις δυναμικές αλληλεπιδράσεις μορίων RNA με ειδικές ριβονουκλεοπρωτεΐνες που τα αναγνωρίζουν. Η απορρύθμιση των παραπάνω διεργασιών μπορεί να οδηγήσει σε μη φυσιολογικές κυτταρικές αντιδράσεις, οι οποίες με τη σειρά τους θα αποτελέσουν τη βάση για την ανάπτυξη παθολογίας, όπως έχει δειχθεί σε περιπτώσεις χρόνιας φλεγμονής και αυτοάνοσων παθολογιών. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή επικεντρωθήκαμε στη μελέτη του λειτουργικού ρόλου μιας ριβονουκλεοπρωτεΐνης η οποία εμπλέκεται στις διαδικασίες του μεταμεταγραφικού ελέγχου και ονομάζεται HuR (ή HuA/Elavl1). Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η HuR αλληλεπιδρά με mRNAs τα οποία κωδικοποιούν φλεγμονώδεις παράγοντες, ή παράγοντες που ελέγχουν τις αντιδράσεις του κυττάρου στο στρες. Τα mRNAs αυτά χαρακτηρίζονται από την παρουσία ενός συγκεκριμένου μοτίβου στην 3’ μη μεταφραζόμενη περιοχή τους, το οποίο ονομάζεται στοιχείο πλούσιο σε αδενίνη και ουρακίλη (ARE). In vitro μελέτες υπέδειξαν ότι η ενεργοποίηση των κυττάρων της έμφυτης ανοσιακής απόκρισης από βακτηριακά και φλεγμονώδη ερεθίσματα προκαλεί την αλληλεπίδραση της HuR με mRNAs κυτταροκινών που περιέχουν ARE στοιχεία. Η αλληλεπίδραση αυτή έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση της σταθερότητας των mRNAs και ακολούθως της μετάφρασης τους. Επιπλέον, κλινικές μελέτες υπέδειξαν ότι η μη φυσιολογική έκφραση της HuR σχετίζεται με σοβαρές παθολογικές αντιδράσεις. Παρ’ όλα αυτά, ο λειτουργικός ρόλος της πρωτεΐνης αυτής στον καθορισμό των φυσιολογικών και παθολογικών κυτταρικών αντιδράσεων in vivo ήταν μέχρι σήμερα άγνωστος. Στα πλαίσια της παρούσας εργασίας, αναλύθηκε ο λειτουργικός ρόλος της HuR in vivo, μέσα από την εφαρμογή διαγονιδιακών μεθοδολογιών επιλεκτικής γονιδιακής τροποποίησης στον ποντικό. Στην πρώτη φάση των μελετών μας, αναλύθηκε ο ρόλος της πρωτεΐνης αυτής στη ρύθμιση των έμφυτων ανοσιακών αντιδράσεων μέσα από τη διαγονιδιακή της υπερέκφραση σε διαφοροποιημένους υποπληθυσμούς μακροφάγων και σε χρονικά περιορισμένο πλαίσιο. Με τον τρόπο αυτό είναι δυνατή η άμεση αποτίμηση της δράση της HuR στη γονιδιακή έκφραση κατά τη φλεγμονώδη απόκριση καθώς και η απευθείας συσχέτιση με την ανάπτυξη φλεγμονώδους παθολογίας in vivo. Σε αντίθεση με τις υπάρχουσες θεωρήσεις, η υπερέκφραση της HuR στα μακροφάγα κύτταρα in vivo, προκάλεσε τη καταστολή της μετάφρασης των mRNAs συγκεκριμένων κυτταροκινών παρά τις διαφορικές αντιδράσεις στο ρυθμό της αποικοδόμησης τους. Επιπρόσθετα, χρησιμοποιώντας γενετικά τροποποιημένους ποντικούς από τους οποίους υπολείπονται δύο ριβονουκλεοπρωτεΐνες που σχετίζονται άμεσα με τη φλεγμονή- οι ΤΙΑ-1 και ΤΤΡ- καθώς και ένα πρότυπο σύστημα στο οποίο έχει απορυθμιστεί η λειτουργική ικανότητα του ARE στοιχείου, υποδείξαμε την παρουσία μιας ιεραρχίας με ομοιοστατική δράση στον έλεγχο της φλεγμονής. Σύμφωνα με την ιεραρχία αυτή, η πρωτεΐνη HuR συνεργάζεται με το μεταφραστικό καταστολέα ΤΙΑ-1 προκειμένου να μειωθεί η μετάφραση συγκεκριμένων mRNAs κυτταροκινών, πριν αυτά αποικοδομηθούν από τη δράση της πρωτεΐνης ΤΤΡ. Τα αποτελέσματα μας υποδεικνύουν ότι η πρωτεΐνη HuR έχει πλειοτροπική δράση στη φλεγμονή μέσω των λειτουργικών της αλληλεπιδράσεων με συγκεκριμένα υποσύνολα mRNAs και με μεταμεταγραφικούς ρυθμιστές που έχουν κατασταλτική δράση. Αυτές οι μοριακές αλληλεπιδράσεις έχουν άμεσο και ουσιαστικό αντίκτυπο στην ανάπτυξη της φλεγμονής. Σύμφωνα με τις μελέτες μας, η διαγονιδιακή υπερέκφραση της HuR σε μακροφάγα κύτταρα in vivo λειτούργησε ως αντιφλεγμονώδης διαδικασία και κατέστειλε παθολογικές φλεγμονώδεις αποκρίσεις. Οι παρατηρήσεις αυτές υποδηλώνουν ότι η εφαρμογή στρατηγικών οι οποίες αποβλέπουν στη θεραπευτική ρύθμιση της HuR θα μπορούσαν να έχουν πιθανό κλινικό όφελος στην αντιμετώπιση της φλεγμονής. Η πλειοτροπική δράση της HuR αναδείχθηκε και μέσα από ένα δεύτερο διαγονιδιακό σύστημα επιλεκτικής απαλοιφής του γονιδίου της, το οποίο δημιουργήθηκε στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής για την ανάλυση του φυσιολογικού ρόλου αυτής της ριβονουκλεοπρωτεΐνης. Χρησιμοποιώντας την πλατφόρμα αυτή, δημιουργήθηκαν μεταλλαγμένοι ποντικοί που υπολείπονται καθολικά του γονιδίου της HuR. Οι μελέτη των ποντικών αυτών υπέδειξε το βασικό ρόλο της HuR στην εμβρυϊκή ανάπτυξη και συγκεκριμένα στο στάδιο της γαστριδίωσης και της δημιουργίας του πλακούντα. Τέλος, η κατασκευή του μεταλλαγμένου γονιδιακού τόπου της HuR επιτρέπει την ιστοειδική απαλοιφή της από κυτταρικούς τύπους με σημαντικό παθοφυσιολογικό ρόλο. Τα νέα ζωικά πρότυπα τα οποία δημιουργήθηκαν στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής σε συνδυασμό με μελλοντικές κυτταρικές και μοριακές αναλύσεις αναμένεται ότι (α) θα αποτελέσουν νέα πειραματικά πρότυπα παθολογίας, (β) θα οδηγήσουν στην ανακάλυψη νέων γενετικών δικτύων που εμπλέκονται σε σημαντικές παθολογίες, (γ) θα αποκαλύψουν πιθανούς θεραπευτικούς στόχους και διαγνωστικά εργαλεία και (δ) θα δώσουν βασικές γνώσεις για τους θεμελιώδεις μηχανισμούς ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης.